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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/75486
標題: | 臺灣飯匙倩心臟毒蛋白於人類紅血球結合部位之研究—分子層次之作用機制探討 STUDIES OF BINDING SITE OF TAIWAN COBRA CARDIOTOXIN ON HUMAN ERYTHROCYTES-AN APPROACH TO EXPLORE THE ACTION MECHANISM IN MOLECULAR LEVEL |
作者: | Juan Chung-Ching 阮忠清 |
出版年 : | 1983 |
學位: | 碩士 |
摘要: | ?了證明心臟毒蛋白(Cardiotoxin)作用於紅血球之部位,我們利用化學修飾法,將胺基酸序列中的第24及第26甲硫基丁氨酸(Methionine)很專一性的以溴化氰切去,發現此衍生物的生物活性幾乎完全消失,但免疫能力依舊存在。利用螢光光度計(Fluorescence spectrophotometer)研究此衍生物與ANS複合物的螢光特性而知發射光譜由原來的540nm波長移徙到480nm,這證明ANS與某一非極性基團結合所致,而此基團群可能就是毒蛋白的第22至第26氨基酸所構成的非極性環(nonpolar loop),如果此種推論正確,則甲硫基丁氨酸被切除後,使特異的結合部位發生立體構造的改變,直接使生物活性降低,甚或消失。 同時,我們將血球細胞以α-chymotrypsin; N-Acetylneuraminidase及Cytochalasin B處理,用以切去一直被認?是離子通透細胞及醣類運轉通道的Band 3;除去細胞膜外主要負電荷來源的Sialic acid或阻絕Actin的結合部位以抑制Actin的聚合,再將處理的血球細胞與碘-125標示之心臟毒蛋白反應,進一步做結合分析(binding assay),顯示出心臟毒蛋白與紅血球之結合不受該處理之影響。 以〔125I〕-CTX繼續研究心臟毒蛋白究竟結合於細胞膜的那一部位時,使碘-125標示之毒蛋白與血球懸浮液在37℃及15℃下反應15分鐘,再製備細胞膜,其次,以0.1N NaOH或0.5% triton X-100個別抽取細胞膜,發現放射性碘-125全部存在無法抽取的殘留物中,與抽出液,殘留物的化學組成分析做一比較,我們可以確定碘-125毒蛋白的最終標的(target)可能是神經磷脂質(Sphingomyelin),而有少部份在band 1, 2造成aggregate,此種凝聚的band 1, 2也無法被這兩種試劑抽取。 因?PBS (phosphate-buffered saline)係生物系統中細胞培養最廣用的緩衝溶液,我們因而比較它與實驗所用的plasma expander(代用血漿,商品名?Moriamin)之效果,發現血球在PBS內很快沉降,造成實驗上很大的困擾,此外,若血球與毒蛋白在37℃作用時,短時間內?令細胞溶血,無法形成Non-lytic period。凝膠電泳分離法,顯示出血球被毒蛋白作用後,band 3, 4.2, 5含量明顯下降,且易造成band 5和band 1, 2形成凝聚。 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/75486 |
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