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| DC 欄位 | 值 | 語言 |
|---|---|---|
| dc.contributor.advisor | 溫進德(Jin-Der Wen) | |
| dc.contributor.author | Yun-Hsin Pang | en |
| dc.contributor.author | 胖韻馨 | zh_TW |
| dc.date.accessioned | 2021-06-17T03:23:05Z | - |
| dc.date.available | 2023-06-21 | |
| dc.date.copyright | 2018-06-21 | |
| dc.date.issued | 2017 | |
| dc.date.submitted | 2018-06-14 | |
| dc.identifier.citation | 參考文獻
Agalarov, S. C., G. Sridhar Prasad, P. M. Funke, C. D. Stout and J. R. Williamson (2000). 'Structure of the S15,S6,S18-rRNA complex: assembly of the 30S ribosome central domain.' Science 288(5463): 107-113. Aitken, C. E., R. A. Marshall and J. D. Puglisi (2008). 'An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.' Biophys J 94(5): 1826-1835. Ban, N., P. Nissen, J. Hansen, P. B. Moore and T. A. Steitz (2000). 'The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution.' Science 289(5481): 905-920. Berk, V., W. Zhang, R. D. Pai and J. H. Cate (2006). 'Structural basis for mRNA and tRNA positioning on the ribosome.' Proc Natl Acad Sci U S A 103(43): 15830-15834. BONI, Irina V., Igor V. ZLATKIN, and Edward I. BUDOWSKY(1982). 'Ribosomal Protein S1 Associates with Escherichia coli Ribosomal 30‐S Subunit by Means of Protein‐Protein Interactions.' The FEBS Journal 121.2: 371-376. Carter, A. P., W. M. Clemons, Jr., D. E. Brodersen, R. J. Morgan-Warren, T. Hartsch, B. T. Wimberly and V. Ramakrishnan (2001). 'Crystal structure of an initiation factor bound to the 30S ribosomal subunit.' Science 291(5503): 498-501. Duval, Mélodie, et al. (2013). 'Escherichia coli ribosomal protein S1 unfolds structured mRNAs onto the ribosome for active translation initiation.' PLoS biology 11.12: e1001731. Forster, T. (1948). 'Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.' Annalen der Physik 437: 55-75. Kurylo, Chad M., et al. (2016). 'Genome sequence and analysis of Escherichia coli MRE600, a colicinogenic, nonmotile strain that lacks RNase I and the type I methyltransferase, EcoKI.' Genome biology and evolution 8.3: 742-752. La Teana, A., C. O. Gualerzi and R. Brimacombe (1995). 'From stand-by to decoding site. Adjustment of the mRNA on the 30S ribosomal subunit under the influence of the initiation factors.' RNA 1(8): 772-782. Laursen, B. S., H. P. Sorensen, K. K. Mortensen and H. U. Sperling-Petersen (2005). 'Initiation of protein synthesis in bacteria.' Microbiol Mol Biol Rev 69(1): 101-123. Marzi, S., A. G. Myasnikov, A. Serganov, C. Ehresmann, P. Romby, M. Yusupov and B. P. Klaholz (2007). 'Structured mRNAs regulate translation initiation by binding to the platform of the ribosome.' Cell 130(6): 1019-1031. Petrelli, D., A. LaTeana, C. Garofalo, R. Spurio, C. L. Pon and C. O. Gualerzi (2001). 'Translation initiation factor IF3: two domains, five functions, one mechanism?' EMBO J 20(16): 4560-4569. Philippe, C., C. Portier, M. Mougel, M. Grunberg-Manago, J. P. Ebel, B. Ehresmann and C. Ehresmann (1990). 'Target site of Escherichia coli ribosomal protein S15 on its messenger RNA. Conformation and interaction with the protein.' J Mol Biol 211(2): 415-426. Ramakrishnan, V. (2002). 'Ribosome structure and the mechanism of translation.' Cell 108(4): 557-572. Rosenberger, R. F. and G. Foskett (1981). 'An estimate of the frequency of in vivo transcriptional errors at a nonsense codon in Escherichia coli.' Mol Gen Genet 183(3): 561-563. Schlax, P. J. and D. J. Worhunsky (2003). 'Translational repression mechanisms in prokaryotes.' Mol Microbiol 48(5): 1157-1169. Schmeing, T. M., K. S. Huang, D. E. Kitchen, S. A. Strobel and T. A. Steitz (2005). 'Structural insights into the roles of water and the 2' hydroxyl of the P site tRNA in the peptidyl transferase reaction.' Mol Cell 20(3): 437-448. Sengupta J, Agrawal RK, Frank J (2001). “Visualization of protein S1 within the 30S ribosomal subunit and its interaction with messenger RNA.” Proc Natl Acad Sci U S A 98: 11991–11996. Sengupta J, Agrawal RK, Frank J (2001). “Visualization of protein S1 within the 30S ribosomal subunit and its interaction with messenger RNA.” Proc Natl Acad Sci U S A 98: 11991–11996. Shine, J., L. Dalgarno and J. A. Hunt (1974). 'Fingerprinting of eukaryotic ribosomal RNA labelled with tritiated nucleosides.' Anal Biochem 59(2): 360-365. Stryer, L. and R. P. Haugland (1967). 'Energy transfer: a spectroscopic ruler.' Proc Natl Acad Sci U S A 58(2): 719-726. Subramanian AR, van Duin J (1977). “Exchange of individual ribosomal proteins between ribosomes as studied by heavy isotope-transfer experiments.” Mol Gen Genet 158: 1–9. Takyar, S., R. P. Hickerson and H. F. Noller (2005). 'mRNA helicase activity of the ribosome.' Cell 120(1): 49-58. Tedin, Karsten, Armin Resch, and Udo Bläsi (1997). 'Requirements for ribosomal protein S1 for translation initiation of mRNAs with and without a 5′ leader sequence.' Molecular microbiology 25.1: 189-199 | |
| dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/69668 | - |
| dc.description.abstract | 大腸桿菌中編碼核醣體S15蛋白的rpsO基因，其轉錄本的5’端未轉譯區能形成雙髮夾 (double-hairpin) 及偽結 (pseudoknot) 兩種二級結構來調控其自身的轉譯作用，過去研究認為只當偽結形成時核醣體小次單元30S才能與之結合以進行後續的轉譯，但當S15蛋白表現過量時，其會與rpsO基因轉錄本5’ 端未轉譯區形成的偽結結合，使核醣體-mRNA複合體無法進入轉譯前起始階段繼而進行蛋白的合成。目前對於S15蛋白與核醣體-mRNA複合體間的交互作用，以及對其結構的變化會有何影響，使複合體無法進入於轉譯前起始階段的原因則尚未明白。
本篇欲利用單分子螢光共振能量轉移技術去探討rpsO基因轉錄本5’ 端未轉譯區與30S形成轉譯前起始複合物的機制。研究結果發現，此5’ 端未轉譯區確實可形成雙髮夾及偽結結構，與先前研究結果相符。當30S存在時，藉由辨識偽結上裸露的SD (Shine-Dalgarno) 序列並與之結合後就能將RNA下游的二級結構完全解開，同時也發現30S能在雙髮夾結構自發性解開第二個髮夾的瞬間與裸露出的SD序列結合，不過結合後的複合體並不穩定，解開的下游序列傾向摺疊回第二個髮夾結構而迫使30S分離，只有當30S與起始tRNA共同存在才能穩定此核醣體-RNA複合體，並使RNA下游二級解構維持在解開的構型。此外，本篇研究也嘗試探討核醣體S1蛋白在轉譯前起始複合物形成的過程中所扮演的角色。綜合本篇結果可建立rpsO基因轉錄本5’ 端未轉譯區形成轉譯前起始複合物的動態模型，有助於進一步了解轉譯起始階段調控的分子機制。 | zh_TW |
| dc.description.abstract | Escherichia coli ribosomal protein S15 is encoded by the rpsO gene and can regulate its own biosynthesis through the 5’ untranslated region (5’ UTR) of its transcript. The RNA transcript can fold reversibly into a pseudoknot or a double-hairpin conformation. The ribosome only binds to the pseudoknot to initiate the translation reaction. When S15 is in excess in the cell, it will bind to the pseudoknot structure and then block the ribosome from accessing the initeiation site in such a way to stall the translation initiation. How S15 interacts with the mRNA-ribosome complex and influences the conformation of the preintiation complex still remains unclear.
In this study, we investigate the dynamic rearrangements of the rpsO 5’ UTR RNA and the formation of preinitiation complexees using the single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) technique. We show that ribosomal subunit 30S can unwind the local downstream structures after binding to the SD sequence of the pseudoknot. The 30S can bind to the double-hairpin while the SD sequence is transiently exposed from the hairpin . In this case, the 30S-mRNA complex is unstable and thus the downstream sequence will refold into the haipin structure again. In the presence of the initiator tRNA, the 30S-mRNA complex will be stabilized and lead to the formation of the preinitiation complex. In addition, we also try to explore the role of ribosomal protein S1 in the process. In summary, we have established a dynamic model of translation initiation based on the rpsO 5’ UTR , which will provide insight into the molecular mechanism of translation initiation. | en |
| dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-17T03:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-106-R03b43041-1.pdf: 8024333 bytes, checksum: 86449e657ce112ab385e45046fe2c434 (MD5) Previous issue date: 2017 | en |
| dc.description.tableofcontents | 目錄
口試委員審定書 i 致謝 ii 中文摘要 iii ABSTRACT iv 目錄 v 圖目錄 viii 表目錄 xi 第一章 導論 1 1.1 核醣體 1 1.2 轉譯作用 2 1.2.1 簡介 2 1.2.2 起始階段 2 1.2.3 延長及終止階段 3 1.3 核醣體S15蛋白與rpsO基因 3 1.4 核醣體S1蛋白 4 1.5單分子科學與技術 4 1.5.1 簡介 4 1.5.2 螢光共振能量轉移 5 1.6 研究動機 6 第二章 材料與方法 7 2.1 材料 7 2.1.1 勝任細胞品系 7 2.1.2 質體 7 2.1.3 試劑 7 2.1.4 藥品 8 2.1.5 酵素 9 2.1.6 引子設計及載體構築序列 9 2.1.7 溶液 13 2.2 方法 14 2.2.1 核醣體小次單元30S之純化 14 2.2.2 單分子螢光共振能量轉移實驗 (single-molecule FRET, smFRET) 17 第三章 結果 20 3.1 核醣體小次單元30S之純化 20 3.1.1確認純化後核醣體小次單元30S的純度 20 3.1.2 確認小次單元30S蛋白表現 20 3.1.3 胞外轉譯活性測試 (Luciferase reporter assay) 20 3.2 RNA樣本製備 21 3.2.1 胞外轉錄反應 (in vitro transcription) 21 3.2.2 DNA探針與RNA黏合反應 21 3.3 測量RPSOutr不同二級結構之FRET效率 22 3.3.1 雙髮夾結構之FRET 效率 22 3.3.2 偽結結構之FRET效率 23 mPKsSD轉錄本之FRET效率 23 mAC轉錄本之FRET效率 24 3.3.3 RPSOutr下游二級結構解開之FRET效率 25 3.3.4 RPSOutr之FRET 26 3.4 RPSOutr形成轉譯前起始複合物之結構動態變化 27 3.4.1 核醣體小次單元30S造成RPSOutr結構改變 27 3.4.2 起始tRNA協助小次單元30S解開RPSOutr下游二級結構 28 3.4.3 核醣體小次單元30S能使RPSOutr下游二級結構解開 28 3.4.4 RPSOutr下游二級結構被解開後傾向摺回髮夾結構 29 3.5 S1蛋白在RPSOutr形成轉譯前起始複合物所扮演的角色 31 第四章 討論 33 4.1 RPSOutr不同二級結構於轉譯起始作用中的角色 33 4.2 建立RPSOutr形成轉譯前起始複合物之動態模型 34 4.3 核醣體S1蛋白於對RPSOutr在轉譯起始作用的影響 35 4.4 核醣體小次單元30S是否確實與RPSOutr的SD序列結合 36 4.5 tRNAfMet有無攜帶fMet是否影響轉譯前起始複合物之形成 37 4.6 偽結與30S結合前後之FRET效率不同 37 4.7 未來展望 38 參考文獻 39 圖目錄 圖 1. pS15WT-s載體構築示意圖及部分序列示意圖 42 圖 2. pSP6mS1L載體構築示意圖及部分序列示意圖 43 圖 3. RPSOutr結構與修飾螢光分子的DNA探針之黏合設計 44 圖 4. smFRET實驗操作 45 圖 5. 確認純化後核醣體小次單元30S的純度 46 圖 6. 純化之小次單元30S進行SDS-PAGE結果 47 圖 7. 純化之30S組合成核醣體70S後進行胞外轉譯活性測試 48 圖 8. 用於smFRET實驗之轉錄本 49 圖 9. DNA探針與RNA黏合反應結果 51 圖 10. mS2L序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 52 圖 11. 核醣體30S存在時，mS2L之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 54 圖 12. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，mS2L之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 55 圖 13. mPKsSD序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 56 圖 14. 核醣體30S存在時，mPKsSD之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 58 圖 15. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，mPKsSD之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 59 圖 16. mAC序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 60 圖 17. 核醣體30S存在時，mAC之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 62 圖 19. mHP1序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 64 圖 20. 核醣體30S存在時，mHP1之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 66 圖 21. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，mHP1之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 67 圖 22. RPSOutr序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖、FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖、利用HMM分析之時間軌跡圖及結果 68 圖 23. 核醣體30S存在時，RPSOutr之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖、利用HMM分析之時間軌跡圖及結果 70 圖 24. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，RPSOutr之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 72 圖 25. msSD序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 73 圖 26. 核醣體30S存在時，msSD之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 75 圖 27. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，msSD之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 76 圖 28. mS1L序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 77 圖 29. 核醣體30S存在時，mS1L之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 79 圖 30. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，mS1L之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 80 圖 31. 核醣體30S存在時，mS1L及mS2L以HMM分析之時間軌跡圖及結果 81 圖 32. mS1L-5nt序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 82 圖 33. 核醣體30S存在時，mS1L-5nt之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 84 圖 34. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，mS1L-5nt之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 85 圖 35. msSD-5nt序列及結構示意圖、FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 86 圖 36. 核醣體30S存在時，msSD-5nt之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 88 圖 37. 核醣體30S與起始tRNA同時存在時，mSD-5nt之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 89 圖 38. RPSOutr形成轉譯前起始複合物之動態模型 90 圖 39. 核醣體30S與ATA (10 µM) 同時存在時，mS1L之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 91 圖 40. 核醣體30S與ATA (100 µM) 同時存在時，mS1L之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 92 圖 41. ATA (100 µM) 存在時，mS1L之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 93 圖 42. 核醣體30S與攜帶fMet的起始tRNA同時存在時，RPSOutr之FRET-分子螢光強度關係圖及FRET效率直方圖、FRET時間軌跡圖 94 表目錄 表 1. 於smFRET實驗使用之轉錄本核心序列 95 表 2. 經純化後的核醣體小次單元30S之吸光質與濃度 96 表 3. 不同轉錄本於各反應條件下利用HMM分析之結構變化的速率結果 97 表 4. 於smFRET實驗使用之所有轉錄本在不同反應條件下之FRET效率 98 | |
| dc.language.iso | zh-TW | |
| dc.subject | 轉譯起始 | zh_TW |
| dc.subject | 單分子 | zh_TW |
| dc.subject | 螢光共振能量轉移 | zh_TW |
| dc.subject | 核醣體S15蛋白 | zh_TW |
| dc.subject | rpsO基因 | zh_TW |
| dc.subject | r-protein S15 | en |
| dc.subject | FRET | en |
| dc.subject | rpsO 5’ UTR | en |
| dc.subject | single-molecule | en |
| dc.subject | translation initiation | en |
| dc.title | 單分子螢光共振能量轉移應用於rpsO基因轉錄本形成轉譯前起始複合物之動態分析 | zh_TW |
| dc.title | Observing the Formation Dynamics of Preinitiation Complexes on the rpsO Transcript Using smFRET | en |
| dc.type | Thesis | |
| dc.date.schoolyear | 106-2 | |
| dc.description.degree | 碩士 | |
| dc.contributor.oralexamcommittee | 李以仁(I-Ren Lee),張功耀(Kung-Yao Chang) | |
| dc.subject.keyword | rpsO基因,核醣體S15蛋白,轉譯起始,單分子,螢光共振能量轉移, | zh_TW |
| dc.subject.keyword | rpsO 5’ UTR,r-protein S15,translation initiation,single-molecule,FRET, | en |
| dc.relation.page | 99 | |
| dc.identifier.doi | 10.6342/NTU201703758 | |
| dc.rights.note | 有償授權 | |
| dc.date.accepted | 2018-06-15 | |
| dc.contributor.author-college | 生命科學院 | zh_TW |
| dc.contributor.author-dept | 分子與細胞生物學研究所 | zh_TW |
| 顯示於系所單位： | 分子與細胞生物學研究所 | |
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|---|---|---|---|
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