利用單分子技術去探討端粒結合蛋白對於端粒酶的調控機制

Abstract

酵母菌端粒酶的活性會受到端粒相關蛋白的調控，而Cdc13 在其中扮演重要的角色。Cdc13為單股端粒結合蛋白，其可將端粒酶藉由與另外一個調控蛋白Est1結合而補充至端粒末端以促使端粒的合成。Cdc13也會跟Stn1及Ten1結合形成複合物以抑制端粒酶的活性。過去已被報導Cdc13本身有抑制端粒酶的活性，而我們發現Stn1可以加強Cdc13抑制端粒酶活性的效果。為了瞭解這些蛋白是如何調控端粒的長度，我們藉由建立單分子栓球的實驗以應用於檢測這些蛋白和DNA之間的作用關係。我們藉由將Cdc13接上栓球以觀察Cdc13如何與DNA作用的實驗發現布朗運動的情況會受到抑制。為了瞭解Cdc13是如何去造成DNA布朗運動變化，我們運用追蹤布朗運動隨時間變化的路徑觀察DNA接上栓球後布朗運動是否受到Cdc13影響，發現Cdc13會造成DNA的長度被濃縮，並且變化的模式可以主要分成三種：一階變化，二階變化，及消長型變化。藉由觀察布朗運動變化所需的時間，我們發現Cdc13和DNA的作用過程是一種動態變化，並且每次變化的布朗運動值是以接近8的倍數來變化．除此之外，我們藉由原子力學顯微鏡的實驗更進一步的觀察Cdc13是如何造成DNA有長度上的變化，我們發現當DNA接上蛋白時，DNA的長度會明顯縮短，結果和單分子拴球實驗有很高的共同性，同時我們分析了每次DNA縮短的值也接近於用單分子拴球所得到的數值，藉由這些單分子的實驗我們發現Cdc13具備改變端粒構型的能力，這可能說明了Cdc13調控端粒的方式就是藉由改變端粒的構型以保護端粒不被其他酵素攻擊。