建構 Geobacillus thermocatenulatus NTU 03 熱穩定性脂肪酶在大腸桿菌細胞表面之表現系統及生產生質柴油之應用

Abstract

近年原油價格高漲，替代能源開發備受重視，其中生質柴油 (biodiesel) 為一種可再生性能源，可作為石化柴油的替代品。生產生質柴油之製程，使用全細胞生物觸媒 (whole-cell biocatalyst) 之脂肪酶催化法，可克服鹼催化法之催化劑無法回收和產率不高等缺點，且降低酵素純化與分離過程之成本，然而胞內酵素之全細胞生物觸媒受限於細胞壁和細胞膜之屏障而降低轉化效率，研究以細胞表面表現酵素之系統，應用於全細胞生物之生物轉化為近年研究發展之方向。 本研究使用 Lpp-OmpA 融合方式，建構重組 Geobacillus thermocatenulatus NTU 03 脂肪酶 (r03Lip) 之大腸桿菌表面表現系統，表現 Lpp-OmpA-r03Lip 之融合蛋白至大腸桿菌 BL21(DE3) 細胞表面 (cell surface expressed r03Lip, CSEr03Lip)。由西方點墨法、流式細胞儀 (FACS) 和螢光顯微鏡證實 CSEr03Lip 表現於大腸桿菌細胞表面，且不會影響大腸桿菌細胞之生長及外細胞膜結構的穩定性。酵素活性分析證實 CSEr03Lip 具完整之酵素活性，研究結果 CSEr03Lip 之最適反應溫度為 55oC、最適反應 pH 值為 9，熱穩定性和 pH 值穩定性皆與游離態 r03Lip 相似，且部分之金屬離子、界面活性劑和有機溶劑不影響其之活性，顯示 CSEr03Lip 保有高度之活性與穩定性。然而研究發現 CHAPS 提升 CSEr03Lip 活性與穩定性 21.9% 和 28.9%，鎂離子和丙酮 (acetone) 分別降低其活性及穩定性 26.4% 和 55.2%，此現象未見於游離態 r03Lip。 以 CSEr03Lip 與胞內表現 r03Lip (cytosolic expressed r03Lip, CEr03Lip) 作為全細胞生物觸媒進行脂肪酸異丙酯 (FAIPEs) 之轉化。兩者之適合轉化條件為油醇莫耳比 1：4、水含量小於 10% (w/w of oil)、反應溫度 55oC 和生物觸媒使用量 10% (w/w of oil) 以上，分別反應 20 和 28 小時轉化率可達 90% 以上。使用油炸廢棄油為原料，油脂中酸價、過氧化價隨高溫烹調時間而增加，但不影響全細胞生物觸媒對 FAIPEs 之轉化率，將 CSEr03Lip 與 CEr03Lip 之全細胞生物觸媒回收再利用，兩者使用前 4 次內轉化率達 80% 以上。 本研究使用 CSEr03Lip 之全細胞生物觸媒，相較於 CEr03Lip 系統，結果顯示 CSEr03Lip 確實增加轉化速率並降低生產 FAIPEs 之成本，但酵素提升再利用率為未來發展之重點。