活性棘阿米巴原蟲定量方法開發與環境暴露初探

Abstract

棘阿米巴原蟲(Acanthamoeba spp.)為自由型阿米巴原蟲(free-living amoeba, FLA)的一種，存在於土壤、空氣以及人工與自然水體當中。暴露於活性棘阿米巴原蟲可感染棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba keratitis ,AK)、棘阿米巴皮膚炎(Cutaneous acanthamebiasis)以及肉芽腫性阿米巴腦膜炎(Granulomatous amoebic encephalitis, GAE)，目前在環境當中，學術研究多屬定性之棘阿米巴原蟲檢出報告，以致難以量化各式環境之暴露風險。本研究嘗試建立以ethidium monoazide (EMA)搭配即時定量聚合酶連鎖反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)方法，以定量土壤、空氣以及水體中活性棘阿米巴原蟲，並分別於洋蔥田(N=12)、蔬果/香草植物田(N=36)及水稻田(N=5)採集表層土壤，於洋蔥田中央進行空氣採樣(N=12)，於冷卻水塔(N=6)、廢水處理場(N=3)、農田溝渠(N=6)、水稻田(N=6)以及生物實驗室洗眼站(N=4)採集水體，再以所建立之EMA-qPCR及qPCR方法定量樣本中活性與總棘阿米巴原蟲濃度。土壤採樣同時也記錄當時土壤結構(鬆軟、堅硬但有破壞、堅硬)以及植被覆蓋狀況(無植物、有植物)，並於實驗室分析土壤的pH值、含水量及異營性細菌濃度，另於空氣採樣時同步監測空氣中溫度、相對濕度及風速，本研究將土壤、空氣環境因子與活性及總棘阿米巴原蟲濃度進行統計分析，以評估影響土壤與空氣中活性與總棘阿米巴原蟲濃度之顯著相關因子。 在開發定量活性棘阿米巴原蟲部分，本研究將未受熱與受熱棘阿米巴原蟲囊體分別以0、2.3、23 μg/mL EMA或PMA處理5 min，再以500W鹵素燈距離15 cm光照20 min後以qPCR定量，數據結果顯示，經2.3 μg/mL EMA或PMA處理後，並不影響未受熱原蟲囊體準確定量，且可使受熱原蟲囊體下降約3 log DNA quantity，另外EMA-qPCR與PMA-qPCR在定量未受熱與受熱原蟲囊體之DNA上，經魏克森等級和檢定(Wilcoxon rank sums test)顯示無統計顯著差異(P=1.00)。 在定量土壤中活性棘阿米巴原蟲部分，本研究將未受熱與受熱原蟲添加至1X-300X滅菌土壤稀釋液當中，並以0、2.3、23、46 μg/mL EMA處理5 min再以500W鹵素燈距離15 cm或LED燈(PhAST Blue)光照20 min後以qPCR定量，結果發現50X土壤稀釋液搭配2.3 μg/mL EMA處理不影響未受熱原蟲準確定量亦可使受熱原蟲下降約4 log DNA quantity，且鹵素燈與LED燈對於定量未受熱與受熱棘阿米巴原蟲之能力經魏克森等級和檢定無統計上顯著差異(P=0.53)。 洋蔥田表層土壤活性棘阿米巴原蟲平均濃度(3.92×104 cells/g dry wt.)顯著高於蔬果/香草植物田(1.58×104 cells/g dry wt.)及水稻田(6.57×103 cells/g dry wt.)。在總棘阿米巴原蟲方面，洋蔥田平均濃度(8.13×104 cells/g dry wt.)亦顯著高於蔬果/香草植物田(3.23×104 cells/g dry wt.)及水稻田(1.24×104 cells/g dry wt.)。 洋蔥田空氣中活性與總棘阿米巴原蟲平均濃度分別為1.30與3.38 cells/m3，而經魏克森等級和檢定後，採收期總原蟲濃度(4.73 cells/m3)大於採收後(0.42 cells/m3)。 廢水處理廠活性與總棘阿米巴原蟲濃度以曝氣池水最高，分別為6.33×105與6.71×105 cells/L；進水管處之活性與總原蟲濃度次之，分別為4.52×104與5.78×104 cells/L，放流管處之活性與總原蟲濃度最低(5.23×102與1.20×103 cells/L)。冷卻水塔中活性與總棘阿米巴原蟲濃度為3.02×102與4.13×102 cells/L。農田環境中，水稻田水樣之活性與總棘阿米巴原蟲平均濃度分別為2.67×104與3.86×104 cells/L，農田溝渠水樣則降低至2.16×103與4.33×103 cells/L。在實驗室洗眼站樣本則未檢出。 以斯皮爾曼等級相關(Spearman's rank correlation)分析表層土壤中活性與總棘阿米巴原蟲濃度與土壤環境因子(土壤pH值、土壤含水量、土壤異營性細菌濃度、土壤結構以及植被覆蓋)之相關性，發現pH值(5.41-7.60)與土壤表層活性及總棘阿米巴原蟲濃度成正相關(r=0.60, P<0.0001；r=0.43, P=0.001)；土壤異營性細菌濃度(2.21×107-7.74×108 CFU/g dry wt.)也與活性及總原蟲濃度呈正相關(r=0.33, P=0.02；r=0.39, P=0.004)；而土壤含水量(2.19-58.23%)與活性及總原蟲濃度呈現負相關(r=-0.4, P=0.003；r=-0.37, P=0.006)。 以多元線性逐步迴歸(multiple linear regression with stepwise procedure)分析表層土壤中活性與總棘阿米巴原蟲濃度之影響因子，顯示pH值(5.41-7.60)增加可影響活性與總棘阿米巴原蟲濃度(β=21322, P<0.0001和β=37409, P=0.007)，而土壤異營性細菌濃度(2.21×107-7.74×108 CFU/g dry wt.)增加亦有同樣作用(β=0.000064, P=0.007和β=0.00017, P=0.001)。 以斯皮爾曼等級相關分析空氣中活性與總棘阿米巴原蟲濃度(0.11-3.61 與0.20-6.94 cells/m3)、土壤表層活性與總原蟲濃度及環境因子(土壤pH值、土壤含水量、土壤異營性細菌濃度、土壤結構以及植被覆蓋、空氣溫度、空氣相對溼度、空氣風速)之相關性時，發現僅空氣中總棘阿米巴原蟲濃度與土壤植被覆蓋呈現正相關(r=0.52, P=0.08)，顯示農田表面有植被覆蓋時，空氣中總棘阿米巴原蟲濃度較高。 本研究開發活性棘阿米巴原蟲之定量監測方法，並將其應用在土壤、空氣、水體當中以得知棘阿米巴原蟲濃度，並嘗試利用統計方法從土壤及空氣環境因子中找出影響棘阿米巴原蟲濃度變化的因子，然而本研究是偵測Acanthamoeba spp.，包含了致病性及非致病性，需要有研究去說明致病性與非致病性棘阿米巴原蟲在不同環境中的比例，方能清楚知道人在環境當中的暴露風險為何。