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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/62043
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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 王愛玉 | |
dc.contributor.author | Shu-Chien Liao | en |
dc.contributor.author | 廖述建 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-16T13:24:44Z | - |
dc.date.available | 2018-08-29 | |
dc.date.copyright | 2013-08-29 | |
dc.date.issued | 2013 | |
dc.date.submitted | 2013-07-23 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/62043 | - |
dc.description.abstract | 摘要
在高等植物中,蔗糖轉運子與細胞壁蔗糖轉化酶在蔗糖轉運過程中扮演重要的角色,蔗糖轉運子負責將蔗糖以跨越膜系方式進行轉運,而細胞壁蔗糖轉化酶是將胞外蔗糖水解成葡萄糖及果糖,再經由六碳糖轉運子運至細胞中,本論文首要目的是探討這兩個蛋白質在綠竹中之功能。先前研究已從綠竹筍cDNA 庫中選殖出一段蔗糖轉運子之cDNA 序列 (BoSUT1),本研究利用酵母菌表現系統表現重組 BoSUT1 蛋白質,然而,活性及功能性互補試驗結果顯示,在酵母菌中表現之重組 BoSUT1 蛋白質不具蔗糖轉運之活性。細胞內定位分析顯示,BoSUT1 不均勻分布在原生質膜上,可能存在脂筏體中。免疫共沉澱分析發現 BoSUT1 可能與其他蛋白質有交互作用。此外,本研究也選殖了 BoSUT1 之啟動子序列,並找到一些可能參與基因調控之順式調控因子。進一步以培養於試管之綠竹苗作為材料,以 real-time PCR 法來探討不同因子對 BoSUT1 基因表現的影響,結果顯示, BoSUT1 mRNA 量會受到 indole-3-acetic acid、benzylaminopurine 及蔗糖消耗而增加。除了 BoSUT1 外,我們也選殖三個蔗糖轉化酶 (Boβfruct1、Boβfruct2 及 Boβfruct3) 基因之啟動子序列,並分析此三個基因表現情況。由 real-time PCR 分析結果,推測此三個 Boβfruct 基因各自在植物適應環境變化過程中扮演獨特的角色。此外,Boβfruct2 對於細胞外之蔗糖可立即作用,並且對於積貯活性 (sink activity) 的維持扮演必要的角色;Boβfruct3可能為光訊息傳導及 ABA 訊息傳導路徑的一個交叉點。分析未出土綠竹筍粗抽液及部份純化之酵素分劃中發現了較高分子量之蔗糖轉化酶,推測蔗糖轉化酶除了在轉錄層次上受到調控外,也可能具有轉譯後修飾。P. pastoris 表現並純化之重組 Boβfruct3 蛋白質可以在試管中被 SUMOylation;然而,這種修飾作用是否會在植物體內中發生仍不清楚。綜合上述研究結果,顯示BoSUT1 及三種酸性蔗糖轉化酶在綠竹中會受到高度調控,證實這些蛋白質在綠竹生長發育、代謝及逆境反應過程之重要性。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Abstract
In higher plants, sucrose transporters and cell wall invertases play crucial roles in sucrose transportation. Sucrose transporters are responsible for sucrose transport across the membrane system; cell wall invertases catalyze the hydrolysis of apoplastic sucrose to glucose and fructose. The hexoses are in turn transported into cells via hexose transporters. The major objective of this study is to elucidate the roles of the two proteins in bamboo. A putative sucrose transporter (BoSUT1), which was cloned from a bamboo shoot cDNA library and belonged to the SUT5-type sucrose transporters, was transformed into yeast strains for expressing the recombinant proteins. The results of sucrose uptake assay and complementation assay indicated that the BoSUT1 expressed in yeast could not transport sucrose into cells and also failed to complement yeast mutant lacking sucrose transport activity. Subcellular localization analysis showed that BoSUT1 was distributed heterogeneously in the plasma membrane and predominantly present in lipid raft-like structures. Co-immunoprecipitation assay showed that BoSUT1 might interact with other proteins. The promoter regions of BoSUT1 were cloned, and putative regulatory cis-elements were identified. The expression of BoSUT1 in multiple shoots of bamboo that were cultured in vitro under different conditions was analyzed by real-time PCR. The levels of BoSUT1 mRNA were increased by indole-3-acetic acid, benzylaminopurine and the depletion of sucrose. In addition to BoSUT1, the promoter regions of three acid invertase genes (Boβfruct1, Boβfruct2 and Boβfruct3) of bamboo were also cloned and their expression patterns were analyzed. The results of real-time PCR suggested that these three Boβfruct genes have individual roles in the adaption of the plant to environmental changes. Boβfruct2 might also have an essential role in the immediate response of cells to sucrose availability and in the maintenance of sink activity. Moreover, Boβfruct3 might be one of the interacting nodes of the light and ABA signaling pathways. In addition to being regulated at the transcriptional level, the Boβfruct-encoded enzymes might be posttranslationally modified as revealed from the presence of invertases with molecular weight higher than the predicted ones in the crude extract of etiolated bamboo shoots and the partially purified enzyme fractions. An in vitro SUMOylation assay of the recombinant Boβfruct3 proteins that were expressed and purified from P. pastoris showed that the recombinant proteins were able to be SUMOylated; however, whether this modification occurs in planta remains unknown. Taken together, the results of this study show that the expressions of BoSUT1 and different isoforms of acid invertases in bamboo are under complex regulation, which highlights the importance of these proteins in the growth, development, metabolism and stress responses of this plant. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-16T13:24:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-102-F93b47215-1.pdf: 5689250 bytes, checksum: 1e5a4de87b0399b92bcfd125c1a97847 (MD5) Previous issue date: 2013 | en |
dc.description.tableofcontents | 目錄
目錄 I 縮寫表 VIII 摘要 X Abstract XI 第一章 緒論 1 1. 蔗糖在高等植物之生理角色 .1 1.1 醣類運輸之主要型式 1 1.2 能量之儲藏型式 1 1.3 訊息傳導分子 1 2. 植物蔗糖之運輸 3 3. 植物蔗糖轉運子 3 3.1 SUT1 蔗糖轉運子 5 3.2 SUT2 蔗糖轉運子 6 3.3 SUT3 蔗糖轉運子 7 3.4 SUT4 蔗糖轉運子 8 3.5 SUT5 蔗糖轉運子 8 3.6 蔗糖轉運子之基因調節 9 4. 蔗糖轉化酶 11 4.1 蔗糖轉化酶的生化性質 11 4.1.1 酸性蔗糖轉化酶 11 4.1.2 鹼/中性蔗糖轉化酶 12 4.2 蔗糖轉化酶之生理角色 13 4.2.1 液泡型蔗糖轉化酶 13 4.2.2 細胞壁結合型蔗糖轉化酶 14 4.2.3 細胞質型蔗糖轉化酶 15 4.3 蔗糖轉化酶之調控 15 4.3.1 不同醣類之調控 16 4.3.2 植物荷爾蒙之調控 16 4.3.3 逆境之影響 17 4.3.4 抑制因子之調控 18 5. 本論文之研究的源起與目的 19 第二章 材料與方法 21 1. 實驗材料 21 1.1 植物材料 21 1.1.1 綠竹筍及竹葉 21 1.1.2 綠竹苗 (bamboo multiple shoots) 21 1.2 菌株 21 1.2.1 大腸桿菌 (Escherichia coli) 21 1.2.2 酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae) 22 1.3 質體 22 2. 實驗藥品與儀器 24 2.1 實驗藥品 24 2.1.1 一般化學試劑 24 2.1.2 分生實驗用藥品與限制酶 24 2.1.3 培養基 24 2.1.4 放射性藥品 24 2.2 儀器 24 2.2.1 離心機 24 2.2.2 核酸電泳系統 25 2.2.3 蛋白質電泳系統 25 2.2.4 其他儀器 25 3. 方法 25 3.1 DNA 之抽取、檢定與分析方法 26 3.1.1 綠竹筍 total DNA 之抽取 26 3.1.2 大腸桿菌質體 DNA 之小量分離 26 3.1.3 大腸桿菌質體快速檢定 27 3.1.4 DNA 瓊脂糖膠體電泳 27 3.1.5 DNA片段之分離與純化 28 3.1.6 DNA 之限制酶切割 28 3.1.7 DNA 片段之粘接 (Ligation) 28 3.1.8 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 28 3.1.9 PCR 產物之 A-Tailing 反應 29 3.1.10 酵母菌 DNA 之小量分離 29 3.1.11 南方氏雜合法 30 3.1.12 DIG 酵素連結免疫反應與鹼性去磷酸酶呈色反應 30 3.2 質體 DNA 之轉形 31 3.2.1 以大腸桿菌為宿主 31 3.2.2 以酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae) 為宿主 31 3.2.3 轉形株的篩選檢定 32 3.2.3.1 大腸桿菌轉形株 32 3.2.3.2 酵母菌轉形株 33 3.3 RNA 之抽取、檢定與分析方法 33 3.3.1 綠竹筍全部 RNA 之抽取、檢定與分析 33 3.3.1.1 Guanidine thiocyanate-phenol-chloroform 法 33 3.3.1.2 Trizol 法 34 3.3.2 DNase I 處理 34 3.3.3 RNA 甲醛瓊脂糖膠體電泳 34 3.3.4 即時反轉錄酶-聚合酶連鎖反應 (real-time RT-PCR) 35 3.3.4.1 反轉錄反應 (reverse transcription) 反應 35 3.3.4.2 PCR 35 3.3.5 北方雜合法 36 3.4 非放射線性探針之製備與純化 36 3.4.1 探針之製備與 DIG 標誌 36 3.4.1.1 篩選酵母菌轉形株之探針製備 37 3.4.1.2 綠竹筍 BoSUT1、Boβfruct1、Boβfruct2 及 Boβfruct3 專一性探針之製備 38 3.5 Boβfruct1、Boβfruct2、Boβfruct3 及 BoSUT1 啟動子之選殖及序列分析 40 3.5.1 基因啟動子之選殖 40 3.5.2 基因啟動子之序列分析 42 3.6 重組蛋白質之抽取、檢定與分析方法 42 3.6.1 酵母菌表現系統 42 3.6.1.1 以 Saccharomyces cerevisiae SEY6210 為寄主 42 3.6.1.1.1 pYESBoSUT1 表現質體之構築 42 3.6.1.1.2 酵母菌轉形株之篩選 43 3.6.1.1.3 重組 BoSUT1 蛋白質表現及純化 43 3.6.1.1.4 膜蛋白質之純化 44 3.6.1.1.5 以 TALON Metal Affinity Resin 純化重組蛋白質 44 3.6.1.1.6 蔗糖轉運子活性測定–蔗糖攝取實驗 45 3.6.1.2 以 Saccharomyces cerevisiae SUSY7 為寄主 46 3.6.1.2.1 pDRBoSUT1 表現質體之構築 46 3.6.1.2.2 酵母菌轉形株之篩選 47 3.6.1.2.3 蔗糖轉運子功能性分析 47 3.6.2 大腸桿菌表現系列 48 3.6.2.1 重組BoSUT1-L1 、 BoSUT1-L8 及 BoIT1-57 蛋白質表現及純化 48 3.6.2.1.1 表現質體之構築 48 3.6.2.1.2 重組蛋白質表現 50 3.6.2.1.3 重組蛋白質之純化 50 3.6.2.2 重組rBoIT2 及 rBoIT3蛋白質表現及純化 50 3.6.2.2.1 表現質體之構築 51 3.6.2.2.2 重組蛋白質表現及純化 52 3.6.3 蛋白質定量 52 3.6.4 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳 52 3.6.5 Coomassie Brilliant Blue R 染色法 53 3.6.6 蛋白質轉印 53 3.6.7 免疫呈色法 53 3.6.8 免疫沉澱 (Immunoprecipitation) 54 3.6.9 ESI-MS-MS 質譜儀分析 54 3.7 綠竹筍原生質膜分劃與膜蛋白質之純化 55 3.7.1 綠竹筍原生質膜之純化 55 3.7.2 抗界面活性劑膜蛋白質之純化 56 3.8 綠竹筍蔗糖轉化酶之純化 57 3.8.1 綠竹筍酵素粗抽液之製備 57 3.8.2 膠體過濾管柱層析 57 3.8.3 離子交換管柱層析 57 3.8.4 酸性蔗糖轉化酶的活性測定 58 3.9 抗體製備 58 3.9.1 Monospecific 抗體製備 58 3.9.2 BoIT2 多源性抗體製備 59 3.9.3 抗體效價測試 60 3.10 植物組織切片與原位雜合分析 60 3.10.1 固定 (Fixation) 60 3.10.2 脫水 (Dehydration) 60 3.10.3 滲蠟 (Infiltration of paraffin) 61 3.10.4 埋蠟 (Embedding) 61 3.10.5 石蠟切片 (Paraffin section) 61 3.10.6 原位雜合反應 (In situ hybridization) 61 3.10.6.1 組織前處理 (Tissue pretreatments) 61 3.10.6.2 雜合反應 (Hybridization) 62 3.10.7 酵素連結與呈色反應 63 3.11 基因槍轉殖與短暫表現分析 63 3.11.1 植物材料之準備 63 3.11.2 表現質體之構築 63 3.11.3 鎢粒子處理 65 3.11.4 DNA 包覆 65 3.11.5 基因槍操作 65 3.11.6 短暫表現之觀察 66 3.12 綠竹原生質體短暫表現分析 66 3.13 以不同條件處理綠竹多芽體 66 3.13.1 不同條件之處理 66 3.13.2 Real-time RT-PCR 分析 67 3.14 蛋白質 SUMO 修飾作用 67 3.14.1 胞外 SUMO 修飾作用 67 3.14.2 胞內 SUMO 修飾反應 67 3.14.2.1 以人類 SUMO1GG 進行修飾反應 67 3.14.2.2 以阿拉伯芥 SUMO1GG (~5GG) 進行修飾反應 68 第三章 結果與討論 69 1. 綠竹 BoSUT1 之功能探討 69 1.1 BoSUT1 之蔗糖轉運活性探討 69 1.1.1 以 S. cerevisiae SEY6210 為宿主 69 1.1.2 以 S. cerevisiae SUSY7 為宿主 70 1.1.3 討論 70 1.2 啟動子序列之選殖與基因表現分析 72 1.2.1 啟動子之選殖及序列分析 72 1.2.2 BoSUT1 在綠竹不同生長階段之表現 73 1.2.3 糖類及植物荷爾蒙對 BoSUT1 基因表現的影響 73 1.2.4 討論 74 1.3 BoSUT1 之組織及細胞內定位 75 1.3.1 BoSUT1之原位雜合分析 75 1.3.2 BoSUT1 在洋蔥表皮細胞中之定位分析 75 1.3.3 BoSUT1 在綠竹苗原生質體中之定位 75 1.3.4 探討 BoSUT1 是否位於 detergent-resistant membrane 分劃中 76 1.3.4.1 BoSUT1 抗體製備 76 1.3.4.2 檢測 BoSUT1 是否位於 DRM 分劃中 78 1.4 以免疫共沉澱法尋找可能與 BoSUT1 有交互作用之蛋白質 78 2. 蔗糖轉化酶的功能探討 79 2.1 啟動子序列之選殖與基因表現分析 79 2.1.1 啟動子之選殖及序列分析 79 2.1.2 Boβfruct1、Boβfruct2 及Boβfruct3 於不同處理及逆境中之表現分析 81 2.1.2.1 光照及黑暗培養對 Boβfruct 基因表現之影響 81 2.1.2.2 不同醣類對 Boβfruct1 及 Boβfruct2 基因表現之影響 82 2.1.2.3 H2O2對 Boβfruct1 及 Boβfruct2 基因表現之影響 83 2.1.2.4 不同溫度培養對 Boβfruct1 及 Boβfruct2 基因表現之影響 83 2.1.2.5 外加植物荷爾蒙對 Boβfruct1、Boβfruct2 及 Boβfruct3 基因表現之影響 83 2.1.2.6 討論 84 2.2 Boβfruct1、Boβfruct2 及 Boβfruct3 之原位雜合分析 90 2.3 蔗糖轉化酶轉譯後修飾探討 91 2.3.1 分析工具及製備 91 2.3.1.1 表現重組 GST::BoIT1-57 蛋白質 91 2.3.1.2 BoIT1~BoIT3 抗體製備 91 2.3.2 以 BoIT1~BoIT3之 抗體分析綠竹筍中蔗糖轉化酶 92 2.3.3 利用軟體預測 BoIT1-BoIT3 胺基酸序列上可能泛素化 (ubiquitylation) 及 SUMOyaltion 修飾化作用的位置 94 2.3.4 探討 BoIT1-BoIT3 之 SUMOylation 修飾化作用 94 2.3.4.1 以重組 YrBoIT3 蛋白質進行 in vitro SUMOylation 測試 95 2.3.4.2 檢測是否可在大腸桿菌 BLR 中對 rBoIT2 及rBoIT3 進行 in vivo SUMOylation 95 2.3.4.2.1 檢測 hSUMO1 是否可在大腸桿菌 BLR (DE3) 中對 rBoIT3 進行 in vivo SUMOylation 96 2.3.4.2.2 檢測 AtSUMO1、AtSUMO2、AtSUMO3 及 AtSUMO5 是否可在大腸桿菌 BLR (DE3) 中對 rBoIT2 進行 in vivo SUMOylation 97 2.3.4.2.3 檢測 AtSUMO1~5 是否可在大腸桿菌 BLR 中對 rBoIT3 進行 in vivo SUMOylation 98 第四章 結論與未來展望 100 1. 結論 100 2. 未來展望 101 2.1 蔗糖轉運子及蔗糖轉化酶之表現分析 101 2.2 探討 BoSUT1 與蔗糖代謝相關蛋白質是否具有交互作用 101 2.3 BoSUT1 及蔗糖轉化酶之基因調控 101 2.4 蔗糖轉化酶活化及抑制因子之研究 102 參考文獻 103-122 圖與表 123-185 附錄 186-189 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 綠竹 Bambusa oldhamii 之蔗糖轉運:蔗糖轉運子與蔗糖轉化酶之功能探討 | zh_TW |
dc.title | Sucrose transport in green bamboo Bambusa oldhamii:Studies on function of sucrose transporter and cell wall invertase | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 101-2 | |
dc.description.degree | 博士 | |
dc.contributor.coadvisor | 宋賢一 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 張世宗,廖憶純,張珍田,陳慶三 | |
dc.subject.keyword | 蔗糖轉化酶,蔗糖轉運子,脂筏體,免疫共沉澱,啟動子, | zh_TW |
dc.subject.keyword | invertase,sucrose transporter,lipid raft,Co-immunoprecipitation,promoter, | en |
dc.relation.page | 189 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2013-07-24 | |
dc.contributor.author-college | 生命科學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 生化科技學系 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 生化科技學系 |
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