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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 陳振陽(Jen-Yang Chen) | |
dc.contributor.author | Yen-Ju Chen | en |
dc.contributor.author | 陳嬿如 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-16T06:45:23Z | - |
dc.date.available | 2016-10-09 | |
dc.date.copyright | 2014-10-09 | |
dc.date.issued | 2014 | |
dc.date.submitted | 2014-07-28 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/57420 | - |
dc.description.abstract | 許多研究指出EB病毒(Epstein-Barr virus)進入溶裂期複製是造成鼻咽癌的成因之一。EB病毒極早期蛋白Rta是一個轉錄活化子,其表現可以活化EB病毒進入溶裂期複製。先前的研究發現,單純表現Rta蛋白於上皮細胞中可以使細胞週期停滯於G1期,最後導致細胞老化。在誘導型Rta表現HEK293細胞株(293TetER)所建立EB病毒潛伏感染系統EREV8中加入doxycycline誘導Rta蛋白表現後,細胞中的EB病毒開始進行溶裂期複製並且產生出具感染性的病毒顆粒。另外,我們也發現在這幾個Rta表現細胞中都有細胞生長速率降低和細胞代謝活性減少的共同特徵。我們猜測Rta蛋白在上皮細胞造成的細胞週期停滯可能是引起EB病毒再活化的重要因素。基因微陣列晶片分析與相對蛋白質表現動力學分析結果顯示,Rta蛋白可以促使細胞週期抑制子p21和SFN表現量增加,並同時降低一系列細胞週期正向調控子的表現,包括MYC,以限制細胞週期進行。
基因的轉錄作用與基因體的拓撲結構息息相關。例如基因體拓撲結構的組織者CCCTC-binding factor (CTCF)可控制活化態或是抑制態染色質的空間結構並且調控基因的表現。之前的報導指出CTCF結合於MYC基因的啟動子區域可以幫助MYC的轉錄作用。利用電腦分析,Rta與CTCF都辨認著富含GC的DNA序列,且此兩種DNA序列具有高度的相似性。而在Rta可能的DNA結合位置附近常常帶有CTCF的結合位點,因此我們推測Rta蛋白可能會藉由干擾CTCF結合於細胞與病毒基因體以同時控制細胞週期與病毒生活史的進行。結合染色質免疫沉澱法與DNA甲基化分析,我們發現Rta蛋白結合於MYC、CCND1、JUN和CDK6基因調控區域後,該區域的DNA甲基化作用也隨之增加。重要的是,在這些增加甲基化修飾的DNA片段上,CTCF的結合量隨之減少。 同樣的,在EB病毒或卡波西氏瘤疱疹病毒潛伏感染的細胞中,CTCF蛋白也可以分別牽引病毒基因體形成特殊結構,使潛伏期基因能夠被表現出來。而當Rta表現時可藉由提升CpG的甲基化進而干擾CTCF蛋白結合在病毒基因體上的潛伏/再活化控制區與溶裂期DNA複製起始點。因此,Rta藉由干擾CTCF蛋白結合在細胞基因體的能力,使某些基因表現靜默。另一方面,在病毒基因體中Rta藉由移除CTCF而活化病毒溶裂期複製之進行。 本論文的研究結果提供了在上皮細胞中Rta蛋白造成細胞週期停滯與EB病毒再活化、進入溶裂期複製的分子機制。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Accumulating evidence indicated that the lytic cycle replication of Epstein-Barr virus (EBV) also played roles in the development of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Rta, one of the immediate–early proteins of EBV, is a transcriptional activator that reactivates viral lytic cycle replication. In previous studies, Rta expression in the epithelial cells efficiently arrests cell cycle at G1 phase followed by cellular senescence. Therefore, this thesis aimed to investigate (i) the molecular mechanism of Rta-mediated cell cycle arrest; (ii) the correlation between cell cycle arrest and viral reactivations. First, EBV genome-harboring system was established in a doxycycline-inducible Rta expression cell line in HEK293 cell (293TetER), designated as EREV8. Upon doxycycline induction, Rta expression triggered the latent EBV genome from latent to lytic cycle replication and finally produced infectious viral particles. Next, we observed that the common features of these cell lines were with reduced cell growth rate and decreased cellular metabolic activities upon Rta expression. Further, the results of microarray analysis and comparative protein expression kinetics analysis, Rta upregulated the expression levels of cell cycle inhibitors p21 and SFN, and downregulated a number of positive cell cycle regulators to restrict cell cycle progression, including MYC.
The gene transcriptional regulation is highly correlated with the genome topology. CCCTC-binding factor (CTCF), the principal genome organizer, participates in regulating spatial compartments of active and repressive chromatins and modulating gene expression. It was reported that CTCF bound on the promoter region to support the transcription of MYC. Through in silico analysis, we found that the binding sites of CTCF and Rta are both GC rich and share similarities. Many potential Rta binding sites are adjacent to strong CTCF binding peaks. Therefore, we hypothesized that Rta interferes with CTCF binding in the host and viral genomes, which in turn modulate cell cycle and viral lytic cycle progressions simultaneously. Combining chromatin immunoprecipitation assays and DNA methylation analysis, we observed that the CpG methylation levels of the regulatory regions of MYC、CCND1、JUN、and CDK6 were increased upon Rta binding. Importantly, increased CpG methylation of these regions was accompanied by decreased CTCF occupancy. CTCF loops viral genomes that are essential for EBV and KSHV latency. Similarly, Rta elevated the CpG methylation and interfered with CTCF binding on the latency/reactivation control regions and the oriLyt regions of EBV and KSHV genomes. Together, our results indicated that, via interference with CTCF binding, in the host genome Rta may function as a transcriptional repressor in silencing gene expression, while in the viral genome Rta acts as an activator for lytic gene loci by removing a topological constraint initiated by CTCF. Taken together, the results in this thesis provide the molecular mechanism of Rta-mediated cell cycle arrest and viral reactivations in EBV infected epithelial cells. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-16T06:45:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-103-D96445005-1.pdf: 21465413 bytes, checksum: bcd535e89fc81c9ed054c0c51c85a1bd (MD5) Previous issue date: 2014 | en |
dc.description.tableofcontents | 目錄
口試委員審定書 i 誌謝 ii 中文摘要 iii Abstract v 縮寫與基因代號 vii 第一章 序論 1 1.1 EB病毒 (Epstein-Barr virus,EBV) 1 1.1.1 EB病毒的發現 1 1.1.2 EB病毒的結構 1 1.1.3 EB病毒的生活史 1 1.1.4 EB病毒的感染與複製 2 1.1.5 再活化誘導劑 3 1.1.6 EB病毒相關之疾病 4 1.1.6.1 鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma) 4 1.1.6.2 胃癌 (gastric cancer) 5 1.1.6.3 口腔毛狀白斑病 (oral hairy leukoplakia,OHL) 5 1.1.6.4 感染性單核球增多症 (infectious mononucleosis) 6 1.1.6.5 X染色體相關淋巴增生症候群 (X-linked lymphoproliferative syndrome) 6 1.1.6.6 Burkitt氏淋巴癌 (Burkitt’s lymphoma) 7 1.1.6.7 Hodgkin氏病 (Hodgkin’s disease) 8 1.1.7 EB病毒再活化與鼻咽癌之關聯性 8 1.1.8 本節結論 9 1.2 卡波西氏瘤疱疹病毒 (Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV) 9 1.2.1 卡波西氏瘤疱疹病毒的發現 9 1.2.2 卡波西氏瘤疱疹病毒的結構 10 1.2.3 卡波西氏瘤疱疹病毒的生活史 10 1.2.4 卡波西氏瘤疱疹病毒的感染與癌症 10 1.2.5 本節結論 11 1.3 EB病毒極早期蛋白Rta (immediate-early protein Rta) 11 1.3.1 概論 12 1.3.2 Rta蛋白的分子結構 12 1.3.3 Rta蛋白與其他蛋白質的交互作用 12 1.3.4 Rta蛋白轉活化基因轉錄之機制 13 1.3.5 誘導型Rta表現上皮細胞株之建立 13 1.3.6 Rta蛋白表現促使細胞進入老化狀態 14 1.3.7 本節結論 14 1.4 基因體拓撲構造(genome topology)及基因轉錄調控 14 1.4.1 概論 14 1.4.2 轉錄因子CTCF (CCCTC-binding factor) 15 1.4.3 CTCF蛋白的分子結構 16 1.4.4 CTCF蛋白在人類細胞基因體的角色 16 1.4.4.1 疆界蛋白 (boundary protein) 17 1.4.4.2 轉錄因子 (transcriptional factor) 17 1.4.4.3 染色質組織蛋白 (chromatin organizer) 17 1.4.4.4 絕緣體 (insulator) 18 1.4.5 CTCF蛋白在疱疹病毒基因體的角色 18 1.4.5.1 CTCF蛋白在EB病毒基因體的角色 18 1.4.5.2 CTCF蛋白在卡波西氏瘤疱疹病毒基因體的角色 19 1.4.6 DNA甲基化與基因轉錄作用的調控 20 1.4.6.1 DNA甲基化與轉錄作用之關聯性 20 1.4.6.2 DNA甲基化轉移酶與DNA去甲基化酶 20 1.4.6.3 CTCF蛋白與DNA甲基化之關聯性 21 1.4.7 本節結論 22 1.5 實驗目的 22 1.5.1 釐清EREV8與ERKV細胞的特性 22 1.5.2 探討Rta蛋白對細胞生長的影響 23 1.5.2 研究Rta蛋白干擾CTCF蛋白結合於細胞基因啟動子的機制 23 1.5.3 研究Rta蛋白干擾CTCF蛋白結合於病毒基因體的機制 24 1.5.4 在鼻咽癌細胞中建立EB病毒感染的誘導型Rta表現系統 24 第二章 研究材料與研究方法 25 2.1 研究材料: 25 2.1.1 化學藥品與試劑 25 2.1.2 套組試劑 26 2.1.3 細胞株 27 2.1.4 質體 28 2.1.5 抗體 30 2.1.6 溶液 31 2.1.7 儀器 31 2.2 研究方法: 32 2.2.1 細胞培養 (cell culture) 32 2.2.2 免疫螢光染色法 (immunofluorescence assay) 32 2.2.3 西方墨點法 (western blot analysis) 33 2.2.4 以shRNA的慢病毒系統降低CTCF表現量 (lentivirus-based short hairpin RNAs (shRNA) knockdown of CTCF) 33 2.2.5 相對定量反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (relative quantitative RT-PCR) 34 2.2.6 定量細胞中EB病毒與卡波西氏瘤疱疹病毒的基因體套數 (quantification of intracellular EBV and KSHV genomic DNA) 34 2.2.7 利用電腦分析細胞基因體的CTCF辨認區域 35 2.2.8 染色質免疫沉澱法 (chromatin immunoprecipitation assay,ChIP) 35 2.2.9 流式細胞儀分析 (flow cytometric analysis) 36 2.2.10 利用限制酶分析DNA的甲基化 36 2.2.11 共同免疫沉澱分析 (co-immunoprecipitation assay) 37 2.2.12 建立TW01EREVp2089_S與TW01EREVp2089_F細胞株 37 2.2.13 建立TW01EREV_2716與TW01EREV_2619細胞株 37 2.2.14 建立EB病毒液直接感染上皮細胞之方法 37 第三章 實驗結果 39 3.1 分析EREV8細胞的特性 39 3.1.1 EREV8細胞的建立 39 3.1.2 Rta蛋白表現誘發EB病毒進入溶裂期複製 39 3.1.3 Rta蛋白表現促使EB病毒產出具感染力的病毒顆粒 40 3.1.4 比較doxycycline與TPA/NaB對於EREV8細胞進入溶裂期複製的影響 40 3.1.5 本節結論 41 3.2 分析ERKV細胞的特性 41 3.2.1 ERKV細胞的建立 41 3.2.2 Rta蛋白表現誘發卡波西氏瘤疱疹病毒進入溶裂期複製 42 3.2.3 Rta蛋白表現促使卡波西氏瘤疱疹病毒產出具感染力的病毒顆粒 42 3.2.4 Rta蛋白對卡波西氏瘤疱疹病毒溶裂期基因的影響 43 3.2.5 本節結論 43 3.3 Rta蛋白對宿主細胞造成的影響 44 3.3.1 Rta蛋白對細胞生長的影響 44 3.3.2 Rta蛋白對細胞週期的影響 44 3.3.3 Rta蛋白表現的基因微陣列分析 45 3.3.4 本節結論 45 3.4 Rta蛋白對CTCF結合到細胞基因體的影響 46 3.4.1 Rta與CTCF皆參與著MYC轉錄作用的調控 46 3.4.2 Rta結合位置與CTCF結合位置的相似性 46 3.4.3 Rta結合位置與CTCF結合位置的關聯性 46 3.4.4 體外實驗中發現Rta蛋白表現不影響CTCF蛋白結合至CCND1啟動子的量 47 3.4.5 Rta蛋白在細胞中表現可干擾CTCF蛋白結合至細胞基因啟動子的量 47 3.4.6 Rta蛋白藉由增加CpG甲基化現象干擾CTCF蛋白結合至細胞啟動子的量 48 3.4.7 本節結論 48 3.5 Rta蛋白對CTCF蛋白在病毒基因體中的影響 49 3.5.1 CTCF蛋白對病毒基因體的影響 49 3.5.2 EB病毒與卡波西氏瘤疱疹病毒基因體的相似性 49 3.5.3 Rta蛋白表現可影響CTCF蛋白結合至病毒基因體的量 50 3.5.4 Rta蛋白藉由增加CpG甲基化干擾CTCF蛋白結合至病毒基因體的量 51 3.5.5 Rta蛋白與DNA甲基化轉移酶的交互作用 51 3.5.6 本節結論 52 3.6 在鼻咽癌細胞中建立EB病毒潛伏感染的誘導型Rta表現系統 52 3.6.1 TW01EREVp2089_S與TW01EREVp2089_F細胞 52 3.6.1.1 TW01EREVp2089_S與TW01EREVp2089_F細胞的建立 52 3.6.1.2 比較兩細胞中Rta蛋白對病毒蛋白與細胞週期調控蛋白的影響 53 3.6.1.3 比較兩個細胞中Rta蛋白表現所產出的病毒顆粒量 53 3.6.1.4 比較兩個細胞中Rta蛋白表現對細胞生長速率的影響 53 3.6.1.5 本節結論 54 3.6.2 TW01EREV_2619與TW01EREV_2716細胞 54 3.6.2.1 TW01EREV_2619與TW01EREV_2716細胞株的建立 54 3.6.2.2 比較TW01EREV_2619與TW01EREV_2716細胞中病毒進行溶裂期複製的情形 55 3.6.2.3 比較TW01EREV_2619與TW01EREV_2716細胞中Rta表現對細胞生長的影響 55 3.6.2.4 本節結論 56 第四章 討論 57 4.1 細胞週期的停滯與病毒的再活化 57 4.1.1 疱疹病毒極早期蛋白與細胞週期停滯之關聯性 58 4.1.2 細胞分化與病毒的再活化 59 4.2 細胞週期相關基因與病毒生活史之關聯性 60 4.3 Rta蛋白降低細胞基因表現的可能要素 61 4.4 CTCF蛋白對於疱疹病毒基因體的調控 62 4.4.1 CTCF蛋白對於單純疱疹病毒第一型基因體的調控 62 4.4.2 CTCF蛋白對於EB病毒基因體的調控 62 4.4.3 CTCF對於卡波西氏瘤疱疹病毒基因體的調控 63 4.5 DNA甲基化與病毒生活史的關聯性 63 4.5.1 病毒蛋白與細胞基因啟動子甲基化之關聯性 63 4.5.2 EB病毒基因體甲基化與病毒生活史之關聯性 64 第五章 未來展望 66 參考文獻 (references) 70 表與圖 95 表一、基因微陣列分析Rta蛋白正向調控的細胞週期相關基因 95 表二、基因微陣列分析Rta蛋白負向調控的細胞週期相關基因 96 表三、定量PCR反應所使用的引子 97 表四、染色質免疫沉澱法所及DNA甲基化偵測法使用的引子 98 圖一、EB病毒核蛋白1(EBNA1)表現於EREV8細胞核中 99 圖二、Rta蛋白表現促使EREV8細胞中EB病毒溶裂期蛋白表現率 100 圖三、Rta蛋白可促使EREV8細胞中的EB病毒進入溶裂期複製並包裹產生出病毒顆粒 101 圖四、Rta蛋白誘導EREV8細胞產出具感染力的病毒顆粒 102 圖五、比較doxycycline與TPA/NaB誘導EREV8細胞中EB病毒進入溶裂期複製的影響 103 圖六、Rta蛋白誘導ERKV細胞中卡波西氏瘤疱疹病毒產出具感染力的病毒顆粒 105 圖七、Rta蛋白表現可活化卡波西氏瘤疱疹病毒溶裂期基因啟動子 106 圖八、Rta蛋白表現影響細胞的生長速率與代謝速率 107 圖九、Rta蛋白表現影響細胞週期的進行 108 圖十、Rta結合位置與CTCF結合位置的相似性 109 圖十一、Rta蛋白與CTCF蛋白結合在EB病毒基因體的相對位置示意圖 110 圖十二、Rta與CTCF在細胞基因啟動子上結合的相對位置示意圖 111 圖十三、Rta蛋白表現干擾CTCF蛋白結合於細胞基因啟動子上 112 圖十四、Rta蛋白表現促使基因啟動子上的CpG甲基化現象增加 114 圖十五、CTCF蛋白在EB病毒與卡波西氏瘤疱疹病毒扮演抑制溶裂期複製進行的角色 116 圖十六、圖解EB病毒或卡波西氏瘤疱疹病毒基因體在潛伏期與溶裂期之間轉變的模型圖 117 圖十七、經過Phophonoacetic acid (PAA)處理的EB病毒與卡波西氏瘤疱疹病毒無法進行病毒DNA複製 119 圖十八、Rta蛋白表現干擾CTCF結合於病毒基因體 120 圖十九、Rta蛋白表現增加病毒基因體的CpG甲基化 122 圖二十、Rta與DNA甲基轉移酶的交互作用 123 圖二十一、TW01EREVp2089_S與TW01EREVp2089_F細胞株的綠色螢光蛋白表現率 124 圖二十二、比較TW01EREVp2089_S與TW01EREVp2089_F細胞株在Rta表現後病毒溶裂期蛋白與細胞週期調控蛋白的表現 125 圖二十三、Rta表現誘導TW01EREVp2089細胞中的EB病毒產出病毒顆粒 126 圖二十四、觀察Rta蛋白表現時TW01EREVp2089_S/F細胞的生長曲線與細胞代謝率 127 圖二十五、在TW01TetER_19與TW01TetER_16細胞中建立EB病毒潛伏感染細胞株 128 圖二十六、Rta蛋白表現在TW01EREV_2619與TW01EREV_2716細胞中誘導EB病毒極早期蛋白Zta表現率 129 圖二十七、比較Rta蛋白表現於TW01EREV_2619與TW01EREV_2716細胞對潛伏感染EB病毒的影響 130 圖二十八、Rta蛋白過度表現於TW01EREV_2619細胞中,導致細胞凋亡的訊號增加 131 圖二十九、比較Rta蛋白表現於TW01EREV_2619與TW01EREV_2716細胞中對細胞生長的影響 132 附圖 133 附圖一、利用原位雜交法偵測EB病毒在EREV8感染的情形 133 附圖二、觀察ERKV細胞的基本特性 134 附圖三、在體外試驗中發現Rta蛋白表現不會干擾CTCF結合於CCND1啟動子片段上 135 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | EB 病毒極早期蛋白 Rta 在上皮細胞中造成病毒再活化之分子機制 | zh_TW |
dc.title | Molecular mechanisms of Epstein-Barr virus immediate-early protein Rta-mediated viral reactivation in epithelial cells | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 102-2 | |
dc.description.degree | 博士 | |
dc.contributor.coadvisor | 林素芳(Su-Fang Lin) | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 蔡錦華(Ching-Hwa Tsai),陳美如(Mei-Ru Chen),阮麗蓉(Li-Jung Juan) | |
dc.subject.keyword | EB 病毒,Rta,細胞週期停滯,病毒的再活化,CTCF,DNA 甲基化, | zh_TW |
dc.subject.keyword | EBV,Rta,cell cycle arrest,viral reactivation,CTCF,DNA methylation, | en |
dc.relation.page | 135 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2014-07-28 | |
dc.contributor.author-college | 醫學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 微生物學研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 微生物學科所 |
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