點帶石斑魚非特異性毒殺細胞受器蛋白分子的選殖與定性

Abstract

從點帶石斑魚的脾臟選殖出非特異毒殺細胞受器蛋白分子(NCCRP-1) cDNA，包括132 bp 5’端非轉譯區( 5’ untranslated region, 5’ UTR)、699 bp 編碼區 (open reading frame, ORF) 及108 bp 3’UTR，共可轉譯出232個胺基酸。根據Expert Protein Analysis System (ExPASy)網站上的Motif Scan、美國國家生物技術資訊中心 (The National Center for Biotechnology Information, NCBI)的Position-Specific Iterative BLAST進行domain 預測結果顯示，NCCRP-1在第30~228個胺基酸區域為F-box associated (FBA) domain，內含三個功能區塊，分別是N端的proline-rich 區塊、中間的antigen binding 區塊及C端的signal transduction 區塊;但並沒有預測到穿膜區。 NCCRP-1蛋白質分子量推測為26 kDa、等電點是5.06。胺基酸序列多重比對顯示，石斑魚和其他5種海水魚的NCCRP-1一致性在56~84%，和紅笛鯛 (Lutjanus sanguineus)最相近。Q-PCR結果顯示石斑魚受到海水白點蟲感染後第一天NCCRP-1轉錄表現顯著上升，第三天達到最高，第七天降至背景值。利用昆蟲細胞Sf21和桿狀病毒表現系統合成石斑魚NCCRP-1重組蛋白，經SDS-PAGE和西方墨點轉漬法檢驗，分子量約為29 kDa，顯示NCCRP-1 分子經過轉譯後修飾，在Asn171有N-linkage，可能進行醣基化反應;在Gly93及Gly158各有一段N-myristoylation的片段 (GIPAGV及GADKST) ，在Cys10 推測為palmitoylation位置，可能進行脂化反應(Lipidation)。LC Mass/Mass比對重組蛋白確定為石斑魚NCCRP-1 。將NCCRP-1重組蛋白免疫紐西蘭大白兔八週後取得抗血清，硫銨沉澱(部份純化)的免疫球蛋白(Ig)耦合上FITC，進行流式細胞分析周邊及組織內白血球;顯示寄生蟲感染後第四天，細胞膜上RP-1平均表現量(MFI)顯著增加。顯示NCCRP-1是一種可被誘發 (inducible) 的基因，且表現量由低至高。 從流式細胞儀分析及原位雜交皆顯示，石斑魚NCCRP-1+細胞為直徑3-6 μm的白血球。石斑魚受到寄生蟲感染前後，以流式細胞儀測量血液、脾臟、胸腺、鰓、皮膚及頭腎NCCRP-1+細胞佔全部白血球的比例，顯示感染前約佔1%，而感染後則增加到3~19.3%。取石斑魚受海水白點蟲感染後第三天的鰓組織切片，用NCCRP-1 antisense riboprobe進行原位雜交(in situ hybridization)，發現海水白點蟲營養體(trophont)周圍及內部有NCCRP-1+細胞。NCCRP-1+細胞具有毒殺海水白點蟲纖毛幼蟲和被神經壞死病毒(nervous necrosis virus, NNV)感染的細胞的能力。