O 型醣基轉移酶在人類神經母細胞瘤所扮演的角色及其臨床重要性

Abstract

簡單黏蛋白型醣類抗原例如Tn、T、唾液酸-Tn (sTn)、和唾液酸-T (sT) 抗原的異常表現被認為與惡性轉化及癌症病程惡化有關聯性。黏蛋白型O型醣化起始於把N-acetylgalactosamine (即N-乙醯胺基半乳糖，簡稱GalNAc) 從UDP-Gal NAc轉移到目標蛋白的絲胺酸 (serine) 和蘇胺酸 (threonine) 上，進而形成 Tn抗原；這個反應是由N-乙醯胺基半乳糖轉移酶家族 (GalNAc transferases；簡稱GALNTs) 所催化，是一個重要的調控步驟。其中的一員GALNT2 在小鼠胚胎形成過程當中的神經組織有具差別性的表現形態。Tn抗原再接上Gal後，便形成了 core 1，也就是 T 抗原。β1,3-乙醯葡萄糖胺轉移酶家族 (β1,3-N-acetylglucosaminyltransferases；簡稱B3GNT) 參與了core 1 到 core 4 的形成或延長，其中B3GNT3，幾乎單獨地負責把GlcNAc以β1-3 linkage鍵結的方式加到core 1 (T抗原) 上，形成 extended core 1。因此我們研究的主題是探討這兩個醣基轉移酶 (B3GNT3 及 GALNT2) 在人類神經母細胞瘤所扮演的角色。在B3GNT3的研究中，我們利用免疫組織學的方法，發現在愈分化成熟的神經母細胞中，B3GNT3 的表現量及免疫染色強度愈強。另外，B3GNT3 的表現在臨床病理與生物學因子的統計方面，除了與組織分化的程度有相關性外，也與 Shimada 組織學分類屬較佳預後者及較可能存活者，有顯著關聯性。多變項存活分析則發現，與”較早的臨床分期”、”MYCN 無擴增現象” 並列為預後較佳 (五年存活率) 的獨立預後因子。在細胞惡性表現型的實驗中，我們發現 B3GNT3 會抑制神經母細胞的移行及侵犯行為，而且惡性表現型的改變是經由抑制 Akt 及 ERK 的活化所造成的，也解釋了B3GNT3 極有可能是經由細胞分化程度以外的機制，例如改變或修飾細胞表面的O型醣化，進而影響細胞移行及侵犯等惡性行為。在許多腫瘤細胞的行為中，Akt 及 ERK 是 integrins 和 receptor tyrosine kinases 的下游訊息傳遞分子，而之前也有研究顯示 integrins 和 receptor tyrosine kinases 帶有O型聚醣，因此我們認為 B3GNT3 也可能修飾神經母細胞上 integrins 或 receptor tyrosine kinases 的O型聚醣，形成了 extended core 1 的寡醣鏈，進而抑制了神經母細胞的惡性行為。在 GALNT2 的研究中，我們同樣先利用免疫組織學的方法發現，發現在愈分化成熟的神經母細胞中，GALNT2 的表現量及免疫染色強度愈強。另外，GALNT2 的表現在臨床病理與生物學因子的統計方面，與發病年紀較年輕、較早的臨床分期、原發部位為腎上腺以外的位置、國際神經母細胞瘤病理分類被歸類在預後較佳者、及 MYCN 無擴增現象等，有顯著的關聯性。多變項存活分析則顯示 GALNT2 的表現與其他變項 (較早的臨床分期、MYCN 無擴增現象者、國際神經母細胞瘤病理學分類被歸類在預後較佳者) 同為預後較佳 (五年存活率) 的獨立預後因子。神經母細胞瘤細胞經過 GALNT2 過度表現 (overexpression) 處理後會抑制類胰島素生長因子所誘導的細胞行為，包括細胞生長、移行、侵犯等惡性行為；然而，GALNT2減量 (knockdown) 則會促進這三種細胞惡性行為。此結果暗示著，GALNT2 (與B3GNT3 類似) 亦極有可能是經由細胞分化程度以外的機制，例如改變或修飾細胞表面受質的O型醣化，進而影響細胞移行及侵犯等惡性行為。進一步的機制探討則發現 GALNT2 過度表現會修飾類胰島素生長因子接受器上的O型醣化，進而抑制類胰島素生長因子接受器被類胰島素生長因子誘發的二聚體反應 (dimerization)，再影響下游的訊息傳遞。因此我們認為 GALNT2 會經由調控神經母細胞的類胰島素生長因子接受器之訊息傳遞，進而影響神經母細胞的癌症行為，也說明了它在神經母細胞瘤致病機轉所扮演的重要角色。我們認為雖然仍有許多相關的醣基轉移酶可能同時或有前後順序的影響著神經母細胞的行為，但這兩個醣基轉移酶的研究將有助於對神經母細胞腫瘤形成原因的了解，同時也可能有助於對神經母細胞瘤醣化作用標靶治療的發展。

Aberrant expression of the simple mucin-type carbohydrate antigens such as Tn, sialyl-Tn, T, and sialyl-T antigens is associated with malignant transformation and cancer progression. N-acetylgalactosaminyltransferase 2 (GALNT2), one of the enzymes that mediate the initial step of mucin-type O-glycosylation, is responsible for forming Tn antigen. GALNT2 is expressed differentially in nervous tissues during mouse embryogenesis. T synthase galactosylates Tn to form the core 1 (Galβ1→3GalNAc, T antigen). β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase-3 (B3GNT3), formerly called core 1 β3GlcNAcT, is responsible for adding GlcNAc to core 1 (T antigen) in a β1,3 linkage, forming extended core 1 oligosaccharides. However, the roles of these two glycosyltransferases in neuroblastoma (NB) remain unclear. Here we showed that increased B3GNT3 expression evaluated by immunohistochemistry in NB tumor tissues correlated well with the histological grade of differentiation as well as a favorable Shimada’s subset of pathology. Multivariate analyses revealed that positive B3GNT3 expression in tumor tissues predicted a favorable prognosis in NB patients independent of other prognostic markers. B3GNT3 overexpression suppresses T antigen formation and malignant phenotypes including migration and invasion of SK-N-SH cells, whereas B3GNT3 knockdown enhances these phenotypes of SK-N-SH cells. Moreover, B3GNT3 expression decreased phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK), Src, paxillin, Akt, and ERK1/2. On the other hand, we showed that increased GALNT2 expression evaluated using immunohistochemistry in NB tumor tissues correlated well with the histological grade of differentiation as well as younger age at diagnosis, early clinical stage, primary tumor originated from the extra-adrenal site, favorable INPC histology, and MYCN non-amplification. Multivariate analysis showed that GALNT2 expression is an independent prognostic factor for better survival for NB patients. GALNT2 overexpression suppressed IGF-1-induced cell growth, migration, and invasion of NB cells, whereas GALNT2 knockdown enhanced these NB phenotypes. Mechanistic investigations demonstrated that GALNT2 overexpression modified O-glycans on IGF-1R, which suppressed IGF-1-triggered IGF-1R dimerization and subsequent downstream signaling events. Conversely, these properties were reversed by GALNT2 knockdown in NB cells. Our findings suggest that GALNT2 regulates malignant phenotypes of NB cells through the IGF-1R signaling pathway, suggesting a critical role for GALNT2 in the pathogenesis of NB. These results regarding B3GNT3 and GALNT2 may also provide an alternative approach for cancer therapy by means of modulating cancer-specific glycosylation.