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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/54160
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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 陳進庭(Chin-Tin Chen) | |
dc.contributor.author | Wei-Ping Yang | en |
dc.contributor.author | 楊尉屏 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-16T02:42:34Z | - |
dc.date.available | 2020-07-31 | |
dc.date.copyright | 2015-10-12 | |
dc.date.issued | 2015 | |
dc.date.submitted | 2015-07-21 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/54160 | - |
dc.description.abstract | 人類端粒逆轉錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT) 為端粒酶之主要催化單位。在正常體細胞中並不會表達,但會在大部分腫瘤及幹細胞中表現。絕大多數正常體細胞及癌細胞間 hTERT 的表現與否,其轉錄遏阻因子 CTCF (CCCTC-binding factor) 結合區的甲基化程度扮演著關鍵性的角色。本實驗室在先前研究中發現在光動力致壓效應下,可觀察到 hTERT 基因表現降低的原因是透過將 CTCF 結合區去甲基化所造成。過去文獻指出抗癌藥物,如太平洋紫杉醇 (Taxol) 等具有抑制癌細胞 hTERT 基因表現量下降之能力,然作用機制仍不清楚。故本研究主要目的為探討 Taxol 處理後胞內 hTERT 基因表現量降低現象是否與其甲基化程度相關,並期望因此對 hTERT 基因調控機制有更進一步的了解。因此本研究首先以 Taxol 處理癌細胞後,觀察到 hTERT 表現量確實有下降現象,而相關的去甲基化因子 growth arrest and DNA damage-inducible 45α (GADD45α) 及 inhibitor of growth 1 protein (ING1) 表現量則有增加之情形。進一步以亞硫酸氫鹽-基因組測序法 (Bisulfite genomic sequencing, BGS) 證明以 Taxol 處理後會使 CTCF 結合區之甲基化程度降低。最後利用染色質免疫沉澱 (chromatin immunoprecipitation, ChIP) 證明以 Taxol 處理後,GADD45α 及 ING1 蛋白質會鍵結至 CTCF 結合區進行去甲基化。這些結果顯示 hTERT 基因在受到 Taxol 藥物處理後,會促使 GADD45α 及 ING1 蛋白對 CTCF 結合區進行去甲基化,進而使轉錄遏阻因子 CTCF 可順利結合 CTCF 結合區抑制 hTERT 基因轉錄。此外,我們亦使用 Doxorubicin 等藥物處理癌細胞,確認此調控機制並非 Taxol 專一性。因此,我們推論此調控機制可能是細胞在遭受壓力環境之下普遍存在之現象。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Human telomerase reverse transcriptase (hTERT), the catalytic subunit of telomerase, is expressed in most immortalized and cancer cells but not in normal somatic cells. The expression of hTERT has been reported to be associated with the DNA methylation status in its repressor, CCCTC-binding factor (CTCF), proximal exonic binding site. Previously, we have found that oxidative stress induced by photodynamic treatment could reduce the hTERT expression, which resulted from the reducing of DNA methylation on the CTCF binding site. The reduced expression of hTERT was also found in cells treated with Taxol. However, the regulatory mechanism is still unclear. The aim of this study is to investigate whether the reduction of hTERT gene expression in Taxol treated cells relates to the methylation status of hTERT gene. We found that the hTERT gene is down-regulated and the DNA demethylation related proteins, the growth arrest and DNA damage-inducible 45α (GADD45α) and the inhibitor of growth 1 (ING1) protein, are up-regulated in Taxol-treated cancer cells. Using bisulfite genomic sequencing, we found that hypomethylation on the CTCF binding site of hTERT might be responsible for its suppressed down-regulation. Finally, the data of chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay demonstrated that GADD45α and ING1 protein indeed bind to the CTCF binding site and promote the DNA demethylation in cells treated with Taxol. Similar results were also found in cells treated with other chemotherapeutic drug, such as doxorubicin. Taken together, we found that GADD45α and ING1 mediated DNA demethylation of CTCF binding site of hTERT gene may regulate the expression of hTERT under Taxol treatment via recruiting the transcriptional repressor CTCF to the proximal exonic region of hTERT. Telomerase activation plays a critical role in human carcinogenesis through the maintenance of telomeres. The regulatory mechanism of hTERT found in this study might offer a new therapeutic strategy of cancers. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-16T02:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-104-R02B22042-1.pdf: 9491203 bytes, checksum: 4247a34c069954043f1c00852ab061fa (MD5) Previous issue date: 2015 | en |
dc.description.tableofcontents | 誌謝 ii 摘要 iii Abstract iv 目錄 vi 圖目錄 x 第一章 緒論 1 1.1 人類端粒逆轉錄酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT) 1 1.1.1 hTERT轉錄調控機制 2 1.1.1.1 轉錄因子 2 1.1.1.2 甲基化調控 3 1.1.2 p53腫瘤抑制蛋白 (p53 tumor suppressor protein) 4 1.1.3 轉錄因子CTCF(CCCTC-binding factor) 5 1.2 表觀遺傳修飾 (epigenetics) 7 1.2.1 DNA甲基化修飾作用 (DNA methylation) 7 1.2.2 DNA 去甲基化現象 (DNA demethylation) 及相關蛋白質 9 1.2.2.1 DNA 去甲基化現象 (DNA demethylation) 9 1.2.2.2 DNA去甲基化相關蛋白質:Growth arrest and DNA damage-inducible 45α (GADD45α) 11 1.3 藥物作用機制 13 1.3.1 太平洋紫杉醇 (Paclitaxel, Taxol) 13 1.3.2 多柔比星 (Doxorubicin) 14 1.3.3 Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) 16 1.3.4 過氧化氫 (Hydrogen peroxide, H2O2) 16 1.4 研究動機與目的 18 第二章 材料與方法 19 2.1 藥品與儀器 19 2.1.1 藥品 19 2.1.2 細胞培養試劑 21 2.1.3 抗體 22 2.1.4 儀器 22 2.2 細胞株及細胞培養 23 2.2.1 培養基之配製 24 2.2.2 細胞繼代培養 24 2.2.3 細胞冷凍與解凍 25 2.2.4 細胞計數 25 2.3 細胞存活率分析:細胞計數 26 2.4 細胞群落形成之分析 (Colony formation assay) 26 2.5 藥物處理 27 2.5.1 Taxol 處理 27 2.5.2 Doxorubicin 處理 27 2.5.3 Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)處理 27 2.5.4 H2O2處理 28 2.6 mRNA定量分析 28 2.6.1 RNA 萃取 (RNA extraction) 28 2.6.2 反轉錄 (Reverse Transcription, RT) 29 2.6.3 聚合酶鏈鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 29 2.6.4 洋菜膠體電泳分析 30 2.7 即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, real-time PCR) 31 2.8 質體建構 31 2.8.1 目標基因序列的PCR放大 32 2.8.2 TA cloning 33 2.8.3 質體建構 33 2.9 細胞轉染 (Plasmid Transfection) 34 2.10 西方墨點法 (Western blot) 35 2.10.1 蛋白質萃取(Protein extraction) 35 2.10.2 蛋白質定量 (Protein quantification) 35 2.10.3 膠體電泳與轉印 (SDS-PAGE electrophoresis and Transfer) 35 2.10.4 化學冷光免疫分析法 (Chemiluminescence Immunoassay, CLIA) 36 2.11 亞硫酸氫鹽-基因組測序法 (Bisulfite genomic sequencing, BGS) 37 2.12 染色質免疫沉澱 (chromatin immunoprecipitation, ChIP) 38 2.13 統計分析 40 第三章 結果 41 3.1 Taxol 處理對細胞存活率及形態之影響 41 3.2 Taxol 處理對 hTERT 表現之影響 41 3.3 Taxol 處理對 hTERT 之 CTCF 結合區甲基化程度的影響 42 3.4 Taxol 處理對 DNMT-1、GADD45α、ING1 及 p53 表現之影響 43 3.4.1 Taxol 處理對 DNMT-1 及 GADD45α mRNA 表現之影響 43 3.4.2 Taxol 處理對 GADD45α、ING1 及 p53 蛋白質表現之影響 44 3.5 GADD45α 及 ING1 在 Taxol 處理後結合 hTERT 轉錄遏阻因子 CTCF 結合區之情形 45 3.6 hTERT 與 ING1 及 GADD45α 之關聯性 46 3.6.1 提升 PC3 細胞之 ING1 及 GADD45α 表現對 hTERT 的影響 46 3.6.2 抑制胞內 GADD45α之表現對 Taxol 調控 hTERT 的影響 47 3.7 Doxorubicin、FCCP 及 H2O2 處理對細胞存活率及 hTERT、GADD45α 表現之影響 47 3.7.1 Doxorubicin 處理對細胞存活率及 hTERT 及 GADD45α mRNA 表現之影響 48 3.7.2 FCCP 處理對細胞存活率及 hTERT 及 GADD45α mRNA表現之影響 48 3.7.3 H2O2 處理對細胞存活率及 hTERT 及 GADD45α mRNA表現之影響 49 3.8 Doxorubicin 處理對 hTERT 之 CTCF 結合區甲基化程度的影響 50 3.9 GADD45α 及 ING1 在 Doxorubicin 處理後結合 hTERT 轉錄遏阻因子 CTCF 結合區之情形 50 3.10 p53 和 GADD45α 及 ING1 調控 hTERT 表現之關聯性 51 3.10.1 抑制胞內 p53 之表現對 Taxol 調控 hTERT 及 GADD45α 的影響 51 3.10.2 Taxol 處理 LNCaP 及 PC3 細胞株對 hTERT 及 GADD45α mRNA 表現之影響 52 3.11 抗氧化劑 (ROS scavenger) 對Taxol及 FCCP 調控 hTERT及GADD45α 之影響 53 第四章 討論 55 4.1 Taxol 對 hTERT 表現量之調控機制 55 4.2 hTERT 之轉錄遏阻因子 CTCF 結合區去甲基化現象 56 4.3 hTERT 和 GADD45α 及 ING1 之關聯性 57 4.4 在 Taxol 作用之下 hTERT 和 GADD45α 與 p53 之關聯性 59 4.5 ROS 影響 GADD45α 將 hTERT 之 CTCF 結合區去甲基化之調控角色 60 第五章 結論與未來工作 62 圖 63 附錄 91 參考文獻 97 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 以太平洋紫杉醇引發之 hTERT 表現量下降探討其CTCF 結合區上 DNA 甲基化之調控機制 | zh_TW |
dc.title | Investigating the regulatory mechanism of DNA methylation on the CTCF-binding regions of hTERT down-regulated by Taxol | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 103-2 | |
dc.description.degree | 碩士 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 張麗冠(Li-Kwan Chang),林晉玄(Ching-Hsuan Lin),李銘仁(Ming-Jen Lee) | |
dc.subject.keyword | hTERT,CTCF,GADD45α,ING1,DNA demethylation, | zh_TW |
dc.relation.page | 117 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2015-07-21 | |
dc.contributor.author-college | 生命科學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 生化科技學系 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 生化科技學系 |
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