薄層菌屬系統分類、鐮胞菌比較基因體學及分析重蓋靈芝之交配基因座特性

Abstract

真菌的族群結構與演化對於分子育種以及防治具重要性，牛樟芝、靈芝以及鐮胞菌皆為重要真菌，惟利用類緣分析、功能分析以及比較基因體學進行真菌分子育種以及菌株鑑定選定特殊標的，以及針對性防治等的研究資訊較為缺乏。因此，進行牛樟芝近鄰薄層菌屬以及靈芝的類緣分析、藉由基因選殖、特性界定、轉形驗證交配型基因功能的重蓋靈芝以及比較基因體學在鐮胞菌的應用。在類緣分析上，薄層菌屬(Antrodia spp.)為多孔菌，尤其常棲息於針葉樹林，引起褐腐。此薄層菌屬有些成員為藥用真菌，另外有些成員在生物復育(bioremediation)上具有應用的潛力。本研究採用了44株分離株，包含20種薄層菌屬真菌，5種小薄孔菌屬以及9種多孔菌的核醣體小次單元序列(18S)，內轉錄間隔區(ITS)，核醣體大次單元序列(28S)。全盤分析，包含這44株分離株以及來自NCBI(National Center for Biotechnology Information)基因庫共161株分離株，包含77屬，138種多孔菌的大次單元核醣體序列，利用最大簡約法(maximum parsimony)進行分析，從種系發生圖(phylogram)可以得知薄層菌屬為一異質性多源的屬，可以分成至少8個群。更深入研究，利用最大簡約法(maximum parsimony)、最大似然法(maximum likelihood)、相鄰連接法(neighbor joining)、貝葉氏導出法(Bayesian inference)等方法，分析合併之18S-5.8S-28S序列，以及應用貝葉氏導出法分析ITS1-ITS2序列，結果亦顯示多源性之類緣圖，雖然並非所有之分支皆具有高度之支持度。此外，更進一步以不受限的類緣分析，利用Templeton，Winning-site，Kishino Hasegawa以及Shimodaira Hasegawa等方法驗證，也支持薄層菌屬為一異質性多源的屬。其中包括第三群A. radiculosa以及A. vaillantii，其與第二群類緣的相關性，也支持Fibroporia獨立成屬；而單系群的第一群原先被歸類於Amyloporia屬，包含有六個種，具澱粉質或弱澱粉質或無澱粉質的特徵。Antrodia gossypia以及Antrodiella lalashana應重新組合，以及多源性的Phlebia屬之系統分類歧異仍需更深化研究及整合。為了解決分支支持度的問題，採用22個必需基因在82個菌株上的類緣分析，成功提高分支支持度。此外，利用最大似然法以及266種多孔菌，包含26種Antrodia物種及3種Fibroporia, 6 種Amyloporia, 2種Taiwanofungus也證實8個群的分類體系。這些結果與型態進行比較，推估多孔菌類族群應為具有不完全遺傳系分離（incomplete lineage sorting）的現象。在分子育種方面，重蓋靈芝(Ganoderma multipileum)屬於靈芝屬, 為藥用真菌, 具免疫調節與抗癌症活性潛能。目前重蓋靈芝的交配型與出菇基因之分子生物學方面的探討仍付闕如。本研究首先建構基因體基因庫以及表達序列標籤(expressed sequence tag)，其次，藉由分子標記blast搜尋cDNA基因庫獲得四個基因a1，a2，b1，以及b2，分別具有homeodomain，辨識，雙分子化以及DNA結合等功能，其在交配型A1以及A2基因座已被選殖出來並且界定特性。另外，利用類似途徑亦獲得20個費洛蒙前驅物以及21個費洛蒙受體。利用專一性的探針進行點墨式雜合(dot blot hybridization)去分析fosmid基因庫，已組合出BCRC 37177(A1B1)以及BCRC 37180(A2B2)具有a1，a2，b1，b2，費洛蒙前驅物，費洛蒙受體以及附近的基因群的基因座，對該基因座進行註解並經由散彈槍定序序列組合成圖譜。同源基因座分析(Synteny analysis)在A交配型基因座可以顯現出與其他模式物種具有保守性。藉由最大似然法(maximum likelihood，ML)分析方法可以將B1以及B2基因座上的費洛蒙受體以及其他物種區分為8個類群，印證跨物種多型性（Trans species polymorphism）、基因選擇性剪切（alternative splicing）以及基因座間重組，間接推衍四極異宗可能轉換成二極異宗機制之模式。此結果可以推估重蓋靈芝的祖先是一個群體，符合前一研究的論點。也利用原生質體融合PEG選殖變異之琥珀酸脫氫脢（point mutated succinate dehydrogenase）成功建構轉型平台。鐮胞菌比較基因體學分析發現香蕉黃葉病菌第四型生理小種專一性的基因以及可能供化學機械式或綜合防治目標基因，並推估感染香蕉第一型和第四型的特徵可能是一種趨同演化。總結而言，不完全的嫡系分配（incomeplete lineage sorting）為可能的真菌族群演化模式。