大腸桿菌ClpYQ蛋白酶透過ClpY對其基質SulA進行辨識、解構及轉送至蛋白酶活性區之研究

Abstract

ATP依賴型蛋白酶為細胞進行蛋白質品質調控扮演一重要角色，透過ATP的水解做為能量的來源，將具有危害性的蛋白質降解，以維持細胞的正常生理功能。而ClpYQ蛋白酶亦為ATP依賴型蛋白酶之一，透過具有ATPase及Unfoldase的ClpY來進行基質的辨識、結合、解構及轉送入ClpQ蛋白酶中的動作。SulA為具有抑制細胞分裂功能之蛋白，於SOS反應下會被大量誘導表現，以避免受損的DNA傳遞到子代，當DNA修復完成後，其必須被細胞質內的蛋白酶分解，以重新恢復細胞分裂的進行。目前已知會對SulA進行降解之蛋白酶有：Lon及ClpYQ蛋白酶，於先前的研究中指出，Lon會透過SulA C端末8個胺基酸來進行辨識，而SulA蛋白第141-150個胺基酸片段則被認為可能對ClpY進行辨識具有重要性。本實驗中，於in vitro下觀察各SulA之C端缺失突變蛋白與ClpY之交互作用，發現ClpY對SulA第141-150殘基區域具有辨識專一性，並通過疏水性作用力進行結合。接著於141-150殘基區域內具保守性之序列 GFIMRP上的疏水性胺基酸進行突變，以與MBP融合之F143A、F143Y、I144N及M145I點突變蛋白於in vivo下偵測其被ClpYQ蛋白酶及以ClpY*Y91F取代野生型ClpY後被降解之情形。實驗結果顯示，ClpYQ蛋白酶無法分解MBP-SulA*F143Y蛋白，若以ClpY*Y91F取代野生型ClpY，則MBP-SulA*F143Y可以被分解，於半衰期測試也發現，MBP-SulA之半衰期約32分鐘，而MBP-SulA*F143Y則在經過2小時後，累積量有稍微下降的情形。由此推測，ClpY上第91個位置與SulA上第143個位置可能是ClpY與SulA產生結合的作用點之一。此外，MBP-SulA*I144N不具有抑制細胞分裂之活性，顯示於第144個位置進行突變，會對SulA本身之生理功能產生改變。由此可知SulA第141-150個胺基酸片段內具保守性之疏水性胺基酸，對於SulA本身的活性及被ClpY辨識並轉送的特性具有重要性。