神經母細胞瘤生物預後因子之研究 —臨床重要性及對外科術式之影響

Abstract

中文摘要 神經母細胞瘤係源自於胚胎神經脊細胞的惡性腫瘤。它是兒童在中樞神經以外最常見的硬性腫瘤(solid tumor)，約佔所有兒童癌症的5~10%。在新生兒的年盛行率約七千分之一，在台灣每年約新增30名病例。這些病人在被發現時，約5成為第4期病患，在積極治療下，其五年存活率也僅約30%。因此，神經母細胞瘤實為兒童癌症的一項重要課題。然而儘管多數的神經母細胞瘤均十分惡性，卻也有相當比例的神經母細胞瘤可自行分化為良性腫瘤，甚至自行消失，由此可見神經母細胞瘤是一種生物行為十分複雜的腫瘤。 目前對於神經母細胞瘤的治療方式主要包括：外科手術、化學治療、放射線治療、及自體骨髓移植。以外科手術而言，由於神經母細胞瘤均原發於腎上腺或交感神經節，因此其腫瘤大多位於後腹腔或脊柱兩側，常會包住主動脈、下腔大靜脈或其他人體重要血管及器官，甚至鑽入脊椎，造成手術切除極度困難及危險，在耗費極大的體力及時間之後也未必能將腫瘤完全切除。然而由於神經母細胞瘤的生物行為十分複雜，有些腫瘤即使切不乾淨，甚至不必切除，預後仍然很好，而有些腫瘤即使切的很乾淨，仍然很快就會復發及惡化。在過去的研究中，針對高期別的神經母細胞瘤，手術切除乾淨與否對預後是否有幫助存在著極大的爭議。這些研究大多只考慮手術本身，而忽略的腫瘤生物行為本身的重要性。 為了了解神經母細胞瘤複雜的生物行為，到目前為止，至少有195種生物預後因子被提出 ，雖然其中僅約10種被認為有臨床的重要性，但是例如MYCN（一種基因轉譯因子）及Trk-A（一種神經生長因子接受器）對於神經母細胞瘤的預後有極大的影響。神經母細胞瘤若帶有多倍數MYCN其預後極差，反之若表現陽性Trk-A則預後較好。忽略了這些生物因子，很可能會誤導了外科治療在神經母細胞瘤的角色。而由於在高期別的神經母細胞瘤中僅約3成帶有多倍數MYCN，另僅約4成表現陽性Trk-A，可見多數的高期別神經母細胞瘤，其腫瘤生物行為無法由MYCN及Trk-A來預測。因此，尋找新的生物預後因子亦是重要的課題。 目前對於神經母細胞瘤的病理成因仍然不明，但大多認知和胚胎神經母細胞無法分化或凋亡有關，因此，可能的生物預後因子也應該和神經母細胞瘤的分化或凋亡有關。我們找到兩個可能的目標蛋白質，一個是Calreticulin，另一個是GRP78。 Calreticulin是一種細胞內質網蛋白，主要是負責新生蛋白質的摺疊、運送，以及鈣離子平衡的調控。在細胞實驗中，Calreticulin曾被發現當神經母細胞分化時會大量增加，且會移至細胞膜表面，而當細胞膜表面的Calreticulin被抑制時，細胞的分化也會被抑制。另外Calreticulin也曾被發現當在細胞中大量表現時會促進細胞的凋亡。由此可見Calreticulin可能和神經母細胞瘤的分化及凋亡有關，有可能可以成為神經母細胞瘤的預後因子。 另外GRP78也是一種細胞的內質網蛋白，和Calreticulin有類似的功能，即負責新生蛋白質的摺疊、運送及鈣離子的調控。GRP78曾被發現在胚胎神經管的神經外皮細胞會大量表現，顯示它和神經的發育可能有關。另外在細胞實驗發現當細胞分化時GRP78會大量增加，而如果GRP78被大量表現時會促進神經細胞的分化，但當GRP78的表現被抑制時，神經細胞的分化也會被抑制。此外，當神經細胞凋亡時，GRP78的mRNA也會特異性的增加，因此，顯然GRP78也和神經母細胞瘤的分化及凋亡有密切的關聯，GRP78也可能成為神經母細胞瘤的預後因子。 基於上述討論，我們進行了以下三個研究。 第一部分，我們想探討MYCN及Trk-A這兩種已知神經母細胞瘤的重要生物預後因子，對於外科在高期別神經母細胞瘤的角色的影響。我們一共收集了10位第3期及35位第4期的神經母細胞瘤病患。依其手術結果分為腫瘤切除乾淨及切除不乾淨兩組。另外，並使用螢光原位接合的方法來檢測腫瘤細胞中MYCN的倍數，以及使用組織免疫染色法來偵測Trk-A的表現。同時將病患的預後依MYCN及Trk-A的結果分為3群，即（1）低危險群： Trk-A陽性且MYCN為單倍數，（2）中危險群：Trk-A陰性且MYCN為單倍數，（3）高危險群：MYCN為多倍數。結果顯示45位病人中有21位腫瘤切除乾淨，另外帶有MYCN多倍數的有15個（33.3%），Trk-A陽性的有17個（37.8%）。腫瘤切除乾淨的這群病人有較高的比率產生手術合併症（33.3%比8%，p=0.036）。低危險群的腫瘤較中危險群或高危險群的腫瘤容易切除乾淨（分別為12/13，4/17及5/15，p<0.001）。在低危險群病人不論腫瘤是否切除乾淨病人均存活，而在高危險群病人，不論腫瘤是否切除乾淨其五年存活率為0%。因此，在這兩群病人其預後與手術方式無關。但在中危險群病人，若腫瘤切除乾淨則五年存活率為66.7%，反之切除不乾淨者則五年存活率僅為23.1%，顯然腫瘤切除乾淨對於這群病患的預後有很大的幫助（p=0.037）。這個研究顯示要將神經母細胞瘤切除乾淨是一種具高度危險的手術。對於具有低危險生物因子的病患，其腫瘤通常很容易切除乾淨且預後極佳。而具有中危險生物因子的病人，儘管手術風險會增加，但盡可能把腫瘤切除乾淨是有助於改善預後。至於具有高危險生物因子的病患，應儘量採取低風險的手術方式，更有效的內科療法才能改善他們的預後。生物預後因子顯然對於高期別神經母細胞瘤的手術方式有重大影響，因此，在進行重大手術之前，能夠越充分了解其生物預後因子，將有助於降低手術風險並改善病患的預後。 第二部分的研究是為了了解Calreticulin的臨床重要性，以及Calreticulin是否可成為神經母細胞瘤的生物預後因子。本研究共收集了68位神經母細胞瘤病患，包括6位第1期，13位第2期，10位第3期，34位第4期，及5位4S期。其中8位沒有臨床症狀而是經由尿液篩檢發現。有22位病患的年齡小於1歲，有37位病患的腫瘤原發於腎上腺，組織病理型態依其細胞分化的程度及比率分為未分化型神經母細胞瘤（35位），正在分化型神經母細胞瘤（20位）及神經節神經母細胞瘤（13位）。我們用組織免疫染色法檢測Calreticulin在腫瘤組織中的表現。另外以西方點墨法來驗證抗體的專一性，並以定量real-time PCR來印證組織免疫染色結果的可靠度。結果顯示68位病人中有32位（47.1%）的腫瘤細胞呈現陽性Calreticulin染色，陽性Calreticulin染色只表現於神經母細胞瘤細胞或神經節細胞，但Schwann氏細胞則不表現，而在18個腫瘤中血管內皮細胞也同時呈現陽性Calreticulin。 這個組織染色可被抗體專一性的抗原所抑制，同時抗體的專一性也進一步地由西方點墨法驗證。另外定量real-time PCR所檢驗腫瘤組織中的Calreticulin的mRNA含量也和組織免疫法的結果相當一致。Calreticulin的陽性率和組織的分化程度成正比，同時在大量篩檢年齡小於1歲，及期別較早（1，2，4S）的病患中也比較高，但在帶有多倍數MYCN者則較低。陽性Calreticulin染色不論在單變項或多變項分析均可預測較好的預後。而即使在高期別（3，4）及單倍數MYCN腫瘤仍具有預測預後能力。本研究證實了Calreticulin的表現和腫瘤組織的分化有密切的正相關，同時可作為神經母細胞瘤病患的生物預後指標。而Calreticulin在高期別及單位數MYCN腫瘤仍具有預測預後能力，更顯示其臨床上的重要性。 第三部分的研究是為了了解GRP78臨床重要性，以及GRP78是否可成為神經母細胞瘤的生物預後指標。延續第二部分的研究，我們同樣收集68位神經母細胞瘤病患，並用相同的研究方法即組織免疫染色，西方墨點法及real-time PCR去檢測GRP78在腫瘤組織的表現。結果和Calreticulin呈現類似的結果。GRP78的染色強度及陽性率和腫瘤組織的分化程度成正相關。同時在期別較早的腫瘤GRP78的陽性率較高，而在帶有多倍數MYCN的腫瘤則陽性率較低。單變項及多變項分析均顯示GRP78之表現可預測良好的預後。而同樣的，GRP78在高期別及單倍數MYCN腫瘤仍具有區別預後之能力。

經由我們一系列的研究，我們發現神經母細胞瘤的生物預後因子對於治療方式尤其是手術方法的選擇有十分重大的影響，在手術前徹底分析其生物因子有助減少合併症並改善預後。而我們也確立了Calreticulin及GRP78這兩種內質網蛋白可作為神經母細胞瘤新的生物預後指標。而由於這兩種蛋白質均和神經母細胞瘤的分化和凋亡有關，因此進一步地探討他們在神經母細胞中的調控，將有助於了解神經母細胞瘤的病理成因，並可作為治療的標的。