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標題: | Ralstonia solanacearum GMI1000 N-醯化高絲胺酸內酯醯化酶之表現及其酵素特性分析 The expressing and characterization of N-acylhomoserine lactone acylase of Ralstonia solanacearum GMI1000 |
作者: | Chen-Ting Liao 廖健廷 |
指導教授: | 李佳音(Chia-Yin Lee) |
關鍵字: | 群體密度調控系統,群體密度調控系統清除機制, N-acylhomoserine lactone,AHL acylase, |
出版年 : | 2007 |
學位: | 碩士 |
摘要: | 本研究利用PCR的方式,次選殖Ralstonia solanacearum GMI1000中的aac基因,利用四種不同的表現載體來建構Aac蛋白的表現菌株,純化此酵素並分析其酵素特性。經由胺基酸序列比對分析,發現Aac與Ralstonia sp. XJ12B的AHL acylase以及Ralstonia metallidurans CH34的penicillin amidase分別有89 %與88 %的相似性,屬於N-terminal nucleophillic (Ntn) family。由軟體預測Aac蛋白為一分子量大小85 kD,pI 8.0,且N端帶有signal peptide的蛋白質。利用四種表現載體,並選擇三種不同的大腸桿菌作為表現菌株,其中以pET43.1a(+) Factor Xa-GMI1000aac重組質體,在表現菌株Rosetta (DE3)2中誘導表現蛋白質,於30 ℃下能夠獲得較多量的可溶性Aac蛋白。而其他兩種重組質體体pET32a(+) Factor Xa-GMI1000aac與pET41a- GMI1000aac,在25 ℃下亦能得到可溶性的Aac蛋白。比較此三種表現系統所誘導表現蛋白質之比活性,其中以pET43.1a(+) Factor Xa-GMI1000 aac系統表現的蛋白質有最高的活性,以C8HSL為基質活性可達59 U/μg。重組Aac蛋白質經純化並去除序列上之融合蛋白後,其最適反應溫度為30 ℃,最適酸鹼值為7.5,在4℃下保存的酵素穩定度,保存至第五天時,活性僅為原來的55 %。Aac對於中長鏈的AHL (C7HSL、C8HSL、C10HSL、C12HSL)具有活性,其中對於C8HSL有最高的比活性,而對於短鏈以及含有氧取代基的AHL (C4HSL、C6HSL、3OC6HSL)則不具分解能力,但對於3OC8HSL則有些微的活性 (2.73 U/μg)。以質譜儀 (Q-Tof Ultima)分析經Aac作用的AHL水解產物,證實產物中有HSL的存在,Aac在AHL分解酵素中屬於AHL acylase可得到直接的証明。 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/28013 |
全文授權: | 有償授權 |
顯示於系所單位: | 農業化學系 |
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