Adipsin 基因在小鼠乳腺之定性分析

Abstract

小鼠乳腺上皮細胞構成的管泡狀結構包埋於乳腺脂肪墊組成乳腺。自發身、懷孕、分娩、泌乳至退乳期，乳腺受到胞外基質的訊息傳導調控，在結構與功能上經過一連串改變。在維持不同發育時期乳腺的功能上有不同的基因參與調控。本實驗室先前利用 RNA 雜合扣除法發現一種脂肪細胞激素稱作 adipsin，其 mRNA 在乳腺退乳第 4 天表現量高於泌乳第 14 天。 已知 adipsin 與補體因子 D 具有相同的基因序列，補體因子 D 在補體替代路徑中為速率限制酵素可活化先天性免疫反應，此外 adipsin 亦能調控脂肪的代謝作用。本研究推測 adipsin 可能為脂肪墊所分泌的細胞激素而參與調控乳腺發育。 本研究旨在探討 adipsin 在小鼠不同發育時期乳腺中的表現模式與表現位置，以作為未來進一步研究其在乳腺功能的基礎。本研究使用半定量 RT-PCR 與西方吸漬法分別分析 adipsin mRNA 與蛋白質表現模式。實驗結果顯示，adipsin mRNA 表現量在懷孕中後期至泌乳期緩慢下降，自退乳第 3 天緩慢上升，並在第 6 天達到高峰並維持高量表現至第 14 天，而在蛋白質表現模式呈現類似的情形。我們使用 RNA 原位雜合技術與免疫組織染色檢測小鼠乳腺冷凍切片中 adipsin mRNA 與蛋白質的表現位置。結果顯示，無論 mRNA 或蛋白質， adipsin 在退乳第 4 天小鼠乳腺組織中皆主要表現於脂肪細胞。然而，本研究意外發現在瓦解的乳泡所形成的乳腺上皮細胞團中亦可發現部份上皮細胞可表現 adipsin。為了將來在 in vivo 或 in vitro 能進一步研究 adipsin 在乳腺中的功能，本研究將 c-Myc epitope 基因序列與小鼠 adipsin 嵌合建構入腺病毒載體而製備出 adipsin重組腺病毒。實驗結果顯示，此重組腺病毒可在小鼠乳腺上皮細胞株 NMuMG 成功地表現出大量的 adipsin 腺病毒重組蛋白。 綜上所述，本研究發現乳腺中 adipsin mRNA 與蛋白質在整個退乳期表現量明顯高於懷孕及泌乳期。另外，adipsin mRNA 與蛋白質在乳腺中的主要表現位置皆為乳腺脂肪墊內的脂肪細胞。目前本研究結果已建立了 adipsin 腺病毒表現系統而在未來可作為更進一步研究 adipsin 在乳腺中功能的工具。

The mouse mammary gland comprises alveoli and duct-like structure formed by mammary epithelial cells that are embedded in the mammary fat pad and is undergoing continuous structural and functinal changes. By using RNA suppression subtractive hybridization technique and dot blotting, we found an adipokine called adipsin had higher mRNA expression level during mamamry involution. Adipsin is known that functions in innate immunity and lipid metabolism. The aim of this study focused on exploring the expression pattern of adipsin in different stages of mouse mammary gland development and further prospect its functions in mammary gland. The expression of adipsin mRNA gradually decreased during pregnancy and lactation and gradually increased from involution day 3, and maintained a high level till day 14. A similar expression pattern of the adipsin protein was identified. By in situ hybridization and immunohistochemitry, adipsin mRNA and protein predominantly expressed in adipocytes and also in some collapsed alveoli clusters of epithelial. For in vitro and in vivo functional studies of adipsin in the future, an adenovirus-based expression system encoding a myc epitope-tagged mouse adipsin was established and could infect and express mouse adipsin abundantly in mouse epithelial cell line NMuMG. Our results indicated that adipsin may be one of the signals conveyed by fat pad, and play a role in the involution stage of mouse mammary gland. An adenovirus-expressed system of adipsin has been established for further functional studies of adipsin in mammary gland.