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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/16284
標題: | 研究RecBCD解螺旋酶做為單股DNA移位酶之機制 Investigating ssDNA Translocase Activities of RecBCD Helicase |
作者: | Cin-ya Chung 鍾興雅 |
指導教授: | 李弘文 |
關鍵字: | RecBCD,DNA解螺旋酶,DNA移位酶,單分子栓球實驗, RecBCD,helicase,translocase,TPM, |
出版年 : | 2012 |
學位: | 碩士 |
摘要: | DNA 解螺旋酶在細胞中負責將雙股DNA解開,產生單股DNA,在DNA的轉錄、轉譯、複製及重組反應中都是非常重要的角色。解螺旋酶的作用機制目前還沒有被完整地定義出來。結構生物學指出,解螺旋酶解開雙股的過程很有可能與此酵素在單股DNA上的移動有關。本研究以RecBCD做為解螺旋酶的模型,利用單分子的方法直接測試解螺旋酶是否以單股DNA移位酶的機制進行解旋。RecBCD主要的功能在於起始同源重組修復反應,並且辨識外來直鏈雙股DNA加以水解。當細胞發生雙股DNA斷裂(double strand breaks)時,RecBCD會自斷裂處開始解旋並水解此雙股DNA。RecBCD由三個次單元組成:RecB(3'->5'解螺旋酶)、RecC、及RecD(5'->3'解螺旋酶)。在此我們以單分子栓球實驗來觀察單一RecBCD酵素在單股DNA上移動的情形。首先我們製造了長大於200個鹼基無二級結構的單股DNA,並在其兩側加上雙股DNA延長。藉由計算接在RecBCD上小球的布朗運動大小,判斷蛋白質行經至DNA的位置。我們觀察到小球的布朗運動一開始從大的晃動,減小至停止晃動並離開,代表著RecBCD能夠從一開始的雙股移動至單股的區域,再繼續前進直到第二段雙股DNA的底端。由不同方向的DNA架設,我們證明RecBCD確實是5'->3'及3'->5'的單股DNA移位酶。此外,當遇到兩段不同方向的單股DNA時,我們也證明RecBCD的RecB和RecD次單元可互相切換已達到繼續移動的目的。 The E. coli RecBCD helicase initiates the repair of DNA double strand break in the homologous recombination pathway. RecBCD is a heterotrimeric enzyme composed of two helicase motors with different polarities: RecB is a 3' -> 5' helicase and RecD is a 5' -> 3' helicase. How RecBCD unwinds and translocates along duplex DNA is not clearly defined. Here we used a single-molecule tethered particle motion (TPM) experiment to visualize the RecBCD helicase translocation over long distance single-stranded (ss) DNA. We first prepared DNA substrates containing a > 200 nt long, unstructured ssDNA gap flanked by a double-stranded DNA end for RecBCD loading. In the TPM experiments, the bead-labeled, biotinylated RecBCD helicases are found to recognize and bind to the blunt, double-stranded DNA end, and successfully translocate along the duplex/single-stranded/duplex DNA substrate, resulting in a gradual decrease in the bead Brownian motion amplitude. Successful observation of RecBCD translocation over long ssDNA gap in either 3' -> 5' or 5' -> 3' direction indicates that wild-type RecBCD functions as an ssDNA translocase. In addition, RecBCD is able to switch its motors between 3'-ssDNA and 5'-ssDNA. |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/16284 |
全文授權: | 未授權 |
顯示於系所單位: | 化學系 |
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