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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/82670
標題: | 利用單分子螢光共振能量轉移實驗分析Cdc13與端粒結合之模式 Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) analysis of telomeric DNA binding by Cdc13 protein |
作者: | Yu-Ting Lin 林郁庭 |
指導教授: | 林敬哲(Jing-Jer Lin) |
關鍵字: | 端粒,Cdc13,Stn1,Ten1,CST complex,單分子螢光共振能量轉移, Telomere,Cdc13,Stn1,Ten1,CST complex,Single-molecule fluorescence resonance energy transfer, |
出版年 : | 2021 |
學位: | 碩士 |
摘要: | 端粒在維持真核生物染色體完整性上扮演重要角色。Cdc13為單股TG1–3端粒DNA結合蛋白,在Saccharomyces cerevisiae中主要以二聚體形式存在,此外,Cdc13與Stn1、Ten1形成CST複合物並結合在端粒末端,可保護端粒DNA序列及調控端粒酶之活性;在傳統生化分析與蛋白結構分析中均顯示Cdc13可特異性地與端粒DNA進行交互作用,然而與端粒穩定結合之Cdc13實際上是如何坐落至端粒DNA上,並和其他蛋白進行「動態」交互作用的,直至今日都還尚未明瞭,因此我們利用單分子螢光共振能量轉移(smFRET)實驗,以觀察Cdc13和端粒DNA間之交互作用。結果顯示,Cdc13與TG12單尾雙股DNA受質結合後,會降低DNA受質之螢光能量轉移效率至兩個不同的數值,即兩種FRET state。除此之外,進一步利用Cdc13-dimer mutant與DNA-binding domain (DBD) mutant蛋白進行實驗,可得知此兩種FRET state分別為Cdc13 monomer和dimer結合至端粒DNA上所造成,且利用即時影像實驗進行動力學分析可發現monomer結合速率較dimer結合速率快。依據實驗結果可建立一初步之Cdc13結合端粒DNA結合模型, Cdc13 以monomer形式優先結合至單股端粒DNA,第二個monomer則接續加入並形成dimer。為了區分Cdc13 monomer和dimer結合模式是否具有相異的生物功能,我們進一步使用smFRET觀察Cdc13與Stn1或Cdc13、Stn1與Ten1間之交互作用。結果表明,Stn1並不會影響Cdc13結合端粒DNA能力,然而CST複合物可能輕微減弱Cdc13和DNA間之親和力。綜合上述,本篇研究透過一單分子實驗建立了一個較為詳細的Cdc13結合酵母菌端粒DNA模式。 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/82670 |
DOI: | 10.6342/NTU202103423 |
全文授權: | 同意授權(限校園內公開) |
電子全文公開日期: | 2023-10-01 |
顯示於系所單位: | 生物化學暨分子生物學科研究所 |
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