Ca2+ 刺激 ScDmc1 組裝至 ScRPA 結合之 DNA 的機制探究

Abstract

同源重組反應為細胞修復 DNA 雙股斷裂時主要的方式之一，而此反應中的第一步驟為同源重組酶組裝到受損的單股 DNA 形成穩定的核蛋白絲。在釀酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae) 的 ScDmc1 可以有效的被 Ca2+ 調控以提高其股交換反應，及抑制其水解 ATP 的能力。我們利用單分子螢光技術發現，在不需要其他輔助蛋白的幫助下，Ca2+ 可以刺激 ScDmc1 組裝到已被 ScRPA 結合的單股 DNA 上，然而此刺激效果並沒有發生在真核生物中另一種同源重組酶 ScRad51。此外，Ca2+ 刺激 ScDmc1 取代 ScRPA 只發生在低鹽(50 mM KCl)條件下，其中的原因為 ScDmc1 在 Ca2+ 存在下，對於只有 9 個鹼基的短 DNA，其結合速率在低鹽條件下與高鹽(150 mM KCl)條件相比較為快速。最後，我們深入探討 ScDmc1 是如何開始成核在被 ScRPA 預先結合的單股上並提出三個可能模型，其一為 ScDmc1 首先成核在雙股並延伸核蛋白絲取代 ScRPA，另一則是成核在單股 3' 尾端並延伸核蛋白絲，最後則是成核在 5' 單/雙股交界處，我們利用螢光分子對修飾在 DNA 基質的不同位置去間接剔除前兩種模型的可能性，並確認了 ScDmc1 在組裝到被 ScRPA 預先結合的單股 DNA 上也對5' 單/雙股交界處展現偏好性。