請用此 Handle URI 來引用此文件:
http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/75107
標題: | 用高壓液柱色層分析儀來鑑別胺基酸與合成的寡勝? HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY IN AMINO ACIDS AND OLIGOPEPTIDES SEPARATION |
作者: | Shiaw-Lin Wu 吳肖麟 |
出版年 : | 1980 |
學位: | 碩士 |
摘要: | 色層分析有多種型式,可廣泛地被用來做為分離與分析的技術。氣柱色層分析已經在這領域有麟很好的貢獻。液柱色層有濾紙、薄層、離子交換以及分子篩等各種型式。但由於它們的低理論板數以及流速慢導致須時很久,所以未能像氣柱色層分析達到很好的效果。 但自從高壓液柱色層分析儀出現後,它所表現的高理論板數以及高流速的效果,降低麟傳統液柱色層分析的不利,而且它可連續使用非常多次,而不像一般傳統液柱色層分析用一次後需再生,所以本實驗就利用此儀器來分離一些重要的生物基本組成要素-胺基酸與寡勝?。一般來說,移動相是極性,靜止相是非極性的稱逆轉相(neveiae phace)。而移動相是非極性,靜止相是極性的稱正常相(normal phace)。本實驗分別用逆轉相與正常相來分離胺基酸與合成的寡勝?。 一、胺基酸的分離 (1) 親水性胺基酸的分離 胺基酸是蛋白質的基本組成單位,一般的胺基酸分析儀器是利用離子親和力的不同而加以分離,但事先須加二氫?三酮水化物呈色(Ninhydrin 呈色),再測其在450nm的紫外光譜儀吸收度。本實驗用高壓液柱色層分析儀在200nm或210nm的紫外光譜儀吸收度來分析胺基酸。不須加任何化學反應試劑。所利用的柱層是非極性的18個碳鏈的矽化合物(C-18 column)。它對拒水性的物質有較強的吸引力。對親水性的物質則沒什?親和力,所以親水性的胺基酸在此分離效果不好。但我們加入一些介面活性劑(detengent)-SDS (sedium Dodecyl sulfate)。可使得親水性的胺基酸與SDS形成非共價性的離子鍵。而SDS的剩餘(side-chaim)拒水性碳氫鍵與18個碳鏈的靜止相可靠此種拒水性的效應而結合。所以大大的增加親水性胺基酸對靜止相的結合力。利用此種效應,我們可成功地分析除親水性的胺基酸。另外,不同的PH值和不同的磷酸鈉 ?(NaH2PO4)濃度。對其結合力也會影響。這是因?在低PH值下,胺基酸帶正價,而SDS的硫酸根(SO4)離子帶負價。此種正負價的吸引,可使胺基酸與SDS緊緊結合,而SDS又靠其剩餘碳氫鍵與靜止相緊緊結合,所以低PH值增加胺基酸在液柱種的停留時間(netention time)。而磷酸鈉?濃度的高低也使決定胺基酸與靜止相結合力的重要因素。若磷酸鈉?濃度很高,則磷酸根(H2PO4-)離子可與硫酸根離子競爭胺基酸離子。若大部份帶負價的磷酸根離子與帶正價的胺基酸根離子結合,而磷酸根離子由於沒有拒水性的碳氫鍵,所以不會與靜止相結合,使得與其結合的胺基酸很快地流出來,但太低濃度的磷酸鈉?,使得胺基酸與SDS結合太緊,導致在液柱中擴散,而使流出?面積變的寬大,對胺基酸的分離效果降低,所以我們選擇適當的PH值與磷酸鈉?濃度,使得分離效果最佳。 (2) 拒水性胺基酸的分離 拒水性的胺基酸,由於對18個碳鏈靜止相本來就有較強的結合性,所以在上述分離親水性胺基酸的條件下會與靜止相結合的更緊,使得用上述條件流不出來,在此我們加強移動相的離子強度,也就是加入可與SDS競爭的離子,使得拒水性的胺基酸與靜止相的結合力減低。本實驗以1莫耳濃度的Na2SO4在0.1莫耳濃度的磷酸鈉?溶液中,與上述分離親水性胺基酸溶液以50%對50%的狀況下混合,可成功地分離出拒水性的胺基酸。而親水性的胺基酸在此情況下,幾乎沒有保留地很快流出。 從上述二個步驟我們可很成功地分出所有混合胺基酸,只有對離胺酸(Lys)與組織胺酸(His)較難分,但離胺酸與組織胺酸在紫外吸收光譜的波長有很大的不同。組織胺酸在230nm的吸收很強,而離胺酸在此波長幾乎不吸收。故利用此不同波長的吸收,可區分這二個不易分出的胺基酸。另外在親水性的胺基酸中,天門冬胺酸(Asp)與天門冬醯胺酸(Asn)也不易分離,但此並不重要。因?在蛋白質水解時,這二種胺基酸均得到天門冬胺酸。另外附帶討論以點,就是色胺酸(Trp)的拒水性極強,故在上述條件下流不出來,此時須將分離拒水性胺基酸溶液濃度加至100%,則色胺酸可流出來。 二、寡勝?的分離 合成的寡勝?均含有保護基,所以較具拒水性,我們用二氯甲烷(CH2Cl2)或氯仿(CHCl3)加些甲醇(CH3OH)來分離這些寡勝?,發現在羥基尾端(C-terminal)的胺基酸與靜止相的結合力較同樣寡勝?,但此胺基酸在氮基尾端(N-terminal)對靜止相的結合力大,此即在羥基的胺基酸對靜止相的影響力大。 三、由上述有保護基的寡勝?,由其剩餘鏈對靜止相的影響力,可預測其在液柱中的保留時間,但沒有保護基的胺基酸則除了剩餘鏈影響之外,溶液的PH值及其中離子強度等,都會影響其在液柱中的保留時間。所以預測就較複雜,我們想由此實驗所建立的模型,逐漸推廣至沒有保護基的勝?,然後到蛋白質的階段。雖然其中要經種種困難的步驟,但我們相信,我們可逐步的去克服它! 色層分析有多種型式,可廣泛地被用來做為分離與分析的技術。氣柱色層分析已經在這領域有麟很好的貢獻。液柱色層有濾紙、薄層、離子交換以及分子篩等各種型式。但由於它們的低理論板數以及流速慢導致須時很久,所以未能像氣柱色層分析達到很好的效果。 但自從高壓液柱色層分析儀出現後,它所表現的高理論板數以及高流速的效果,降低麟傳統液柱色層分析的不利,而且它可連續使用非常多次,而不像一般傳統液柱色層分析用一次後需再生,所以本實驗就利用此儀器來分離一些重要的生物基本組成要素-胺基酸與寡勝?。一般來說,移動相是極性,靜止相是非極性的稱逆轉相(neveiae phace)。而移動相是非極性,靜止相是極性的稱正常相(normal phace)。本實驗分別用逆轉相與正常相來分離胺基酸與合成的寡勝?。 一、胺基酸的分離 (1) 親水性胺基酸的分離 胺基酸是蛋白質的基本組成單位,一般的胺基酸分析儀器是利用離子親和力的不同而加以分離,但事先須加二氫?三酮水化物呈色(Ninhydrin 呈色),再測其在450nm的紫外光譜儀吸收度。本實驗用高壓液柱色層分析儀在200nm或210nm的紫外光譜儀吸收度來分析胺基酸。不須加任何化學反應試劑。所利用的柱層是非極性的18個碳鏈的矽化合物(C-18 column)。它對拒水性的物質有較強的吸引力。對親水性的物質則沒什?親和力,所以親水性的胺基酸在此分離效果不好。但我們加入一些介面活性劑(detengent)-SDS (sedium Dodecyl sulfate)。可使得親水性的胺基酸與SDS形成非共價性的離子鍵。而SDS的剩餘(side-chaim)拒水性碳氫鍵與18個碳鏈的靜止相可靠此種拒水性的效應而結合。所以大大的增加親水性胺基酸對靜止相的結合力。利用此種效應,我們可成功地分析除親水性的胺基酸。另外,不同的PH值和不同的磷酸鈉 ?(NaH2PO4)濃度。對其結合力也會影響。這是因?在低PH值下,胺基酸帶正價,而SDS的硫酸根(SO4)離子帶負價。此種正負價的吸引,可使胺基酸與SDS緊緊結合,而SDS又靠其剩餘碳氫鍵與靜止相緊緊結合,所以低PH值增加胺基酸在液柱種的停留時間(netention time)。而磷酸鈉?濃度的高低也使決定胺基酸與靜止相結合力的重要因素。若磷酸鈉?濃度很高,則磷酸根(H2PO4-)離子可與硫酸根離子競爭胺基酸離子。若大部份帶負價的磷酸根離子與帶正價的胺基酸根離子結合,而磷酸根離子由於沒有拒水性的碳氫鍵,所以不會與靜止相結合,使得與其結合的胺基酸很快地流出來,但太低濃度的磷酸鈉?,使得胺基酸與SDS結合太緊,導致在液柱中擴散,而使流出?面積變的寬大,對胺基酸的分離效果降低,所以我們選擇適當的PH值與磷酸鈉?濃度,使得分離效果最佳。 (2) 拒水性胺基酸的分離 拒水性的胺基酸,由於對18個碳鏈靜止相本來就有較強的結合性,所以在上述分離親水性胺基酸的條件下會與靜止相結合的更緊,使得用上述條件流不出來,在此我們加強移動相的離子強度,也就是加入可與SDS競爭的離子,使得拒水性的胺基酸與靜止相的結合力減低。本實驗以1莫耳濃度的Na2SO4在0.1莫耳濃度的磷酸鈉?溶液中,與上述分離親水性胺基酸溶液以50%對50%的狀況下混合,可成功地分離出拒水性的胺基酸。而親水性的胺基酸在此情況下,幾乎沒有保留地很快流出。 從上述二個步驟我們可很成功地分出所有混合胺基酸,只有對離胺酸(Lys)與組織胺酸(His)較難分,但離胺酸與組織胺酸在紫外吸收光譜的波長有很大的不同。組織胺酸在230nm的吸收很強,而離胺酸在此波長幾乎不吸收。故利用此不同波長的吸收,可區分這二個不易分出的胺基酸。另外在親水性的胺基酸中,天門冬胺酸(Asp)與天門冬醯胺酸(Asn)也不易分離,但此並不重要。因?在蛋白質水解時,這二種胺基酸均得到天門冬胺酸。另外附帶討論以點,就是色胺酸(Trp)的拒水性極強,故在上述條件下流不出來,此時須將分離拒水性胺基酸溶液濃度加至100%,則色胺酸可流出來。 二、寡勝?的分離 合成的寡勝?均含有保護基,所以較具拒水性,我們用二氯甲烷(CH2Cl2)或氯仿(CHCl3)加些甲醇(CH3OH)來分離這些寡勝?,發現在羥基尾端(C-terminal)的胺基酸與靜止相的結合力較同樣寡勝?,但此胺基酸在氮基尾端(N-terminal)對靜止相的結合力大,此即在羥基的胺基酸對靜止相的影響力大。 三、由上述有保護基的寡勝?,由其剩餘鏈對靜止相的影響力,可預測其在液柱中的保留時間,但沒有保護基的胺基酸則除了剩餘鏈影響之外,溶液的PH值及其中離子強度等,都會影響其在液柱中的保留時間。所以預測就較複雜,我們想由此實驗所建立的模型,逐漸推廣至沒有保護基的勝?,然後到蛋白質的階段。雖然其中要經種種困難的步驟,但我們相信,我們可逐步的去克服它! Reverse-phase, high-pressure liquid chromatography has been successive-fully applied to the analysis of all amino acids mixtures. We added SDS detergent to the mobile phase for separating the hydrophilic amino acids of all amino acids mixtures, then we increased the mobile phase ionic strength by adding Na2SO4 for reducing the high capacities of hydrophobic amino acids. We used the 50% solvent system 1 that could separate hydrophilic amino acid mixtures and 50% solvent system 2 for successively separating the hydrophobic amino acid mixtures. Following the above two steps, we could separate all amino acid mixtures. Protected dipeptides & tripeptides, we used the normal phase for separating. We added a little MeOH for increasing the mobile phase polarity that made the peak sharp and separating well. From the capacities of these peptides, we found the C—terminal end amino acids capacities are different from the same amino acids in N—terminal end. |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/75107 |
全文授權: | 未授權 |
顯示於系所單位: | 生化科學研究所 |
文件中的檔案:
沒有與此文件相關的檔案。
系統中的文件,除了特別指名其著作權條款之外,均受到著作權保護,並且保留所有的權利。