利用固定化木瓜酵素進行消旋醯基胺酸之解析

Abstract

利用化學合成方法所得胺基酸及醯基胺基酸衍生物(N-acyl amino acido)，都是不具光學活性之左右旋(D- and L-)消旋混合物(racemic mixture)。若是要得到純粹左旋之異構物(L-isomer)，則須經過光學解析(optical resolution)之過程。目前在工業上大量使用於光學解析之方法有：優先結晶(preferential crystallixation)及酵素處理(enzymatic procedart)二種。 我們提出一種利用木瓜酵素(papin)解析的方法。木瓜酵素除具有水解蛋白質的能力(proteolytic activity)外，對於醯基胺基酸酯類具有立體特異性酯水酵素(stereospecific esterase)的作用，只限於左旋之異構物，其作用如下：(方程式略) R'：醯基，包括苯醯基(benzoyl)，四碳氧醯基(t-butyloxycarbonye)，苯氧醯基(benzyeoxuecarbonye)如此，可?生具有光學活性的左旋醯基胺基酸。 ?了方便於操作，我們更進一步的將木瓜酵素加以固定化(immobilization)。固定的方法是利用離子鍵結合(ionic linkage)將酵素附著在離子交換樹脂上，以達到連續操作的目的。 ?了克服基質的水溶液中溶解度的困難，此反應在水及有機溶劉的混合溶劑化物中進行，因而傳統PH-stat的方法無法適用於酯水解酵素活性分析，我們設計了高壓液體柱層分析(high performance liguid chromatography)的方法取代之。 對於此二種酵素性質的差異，有機溶劉的影響以及對於不同基質之特異性，均將逐一討論之。反應?物的回收，除了可利用有機溶劉抽取外，我們嘗試使用電透析(electrodialysis)的方法，利用離子交換膜(ion-exchange membrane)，在電場中可使帶有電荷之有機離子遷擇性的通過，而達到分離的效果。 結果與討論 一、木瓜酵素的固定化 木瓜酵素是一種鹼性蛋白質(basic protein)，其等電點在8.75，所以在略?酸性的條件下，會被吸附在陽離子交換樹脂(cation exchange resin)上。在我們遷擇的四種樹脂中以Whatman Co.的CM-32 cellulose最?適當。不溶性酵素的酯水解力較未固定的酵素高，但其蛋白質水解活性卻相當低。前者是因?固定化酵素的擔體所帶電荷與基質苯醯基精胺酸乙酯(BAEE)的電荷相反，由於靜電吸引，造成酵素周圍基質濃度提高，故其活性亦隨增加。而後者可能是由於酵素被固定後，大分子基質受立體阻礙(steric hindrance)之限制，不易與酵素分子接近所不能致。甲醇對於樹脂吸附能力的影響，在較低濃度時因造成溶液介電常數(dielectric constant)的降低，使得電荷間吸引力增大，吸附能力隨之增中，但在濃度超過40%以後，因樹脂無法充分膨脹(swelling)，使得吸附能力驟然下降。 二．利用高壓液體柱層分析測定酵素活性 酵素催化所得基質之水解?物，可利用高壓液體層分析將其分離並定量。我們將此法與傳統PH-stat方法的結果比較發現，以PH-stat方法所得之反應速率較HPLC法測得之速率?高。這乃因PH-stat所測得之速率是反應的初速率(initial rate)必然較平均速率為高。但這對動力常數(Kinetic constants)之測定並無影響，二者所得之結果均相同。HPLC方法具有下列幾點優點： 1．操作上較PH-stat方法?簡便. 2．若酵素反應在含高濃度之有機溶劑中，則PH-stat無法適用。 3．在HPLC的層析圖中，可同時觀察到反應物與?物變化之情形。 在往後的實驗中，我們均利用HPLC之方法來代替PH-stat的方法。 三．固定化木瓜酵素的特性 對於固定化木瓜酵素的一些酵素特性與天然狀態的酵素比較如下： 1.papain-CMC聚合體之最適酸度(optimal PH)?PH 8，較天然酵偏向鹼性1.5 PH單位，此乃因CMC擔體帶有負電荷，影響酵素周遭之靜電引力所致。 2.擔體提供酵素對於環境變化之保護機制，如對溫度影響及有機溶劑濃度的影響較天然酵素?不顯著。 3.兩種酵素在50℃下培養長時間，均表現相當之熱穩定性(heat stability)。 四．消旋醯基胺基酸甲酯之解析 二種酵素對不同之醯基胺基酸甲酯，均表現出相同的特異性，二者均具有立體特異性，對右旋之異構物都無法作；對於胺基酸甲酯(amino acid methyl ester)及鄰硝基苯硫基之衍生物(Nps-a.a-OMe)亦無酵素活性，此結果我們可利用Gerwin的假說解釋。他提出木瓜酵素之活性中心(active site)是一個疏水性的裂口(hydrophobic cleft)，而胺基端的保護基(blocking group)，對於其水解基質的能力有決定性的功用。當缺乏此保護基，可該保護基相當小時，則水解作用會受到阻礙。對於鄰硝基苯硫基胺基酸甲酯，可能由於其保護基太大所致，無法接近其活性中心。 另外，此二酵素對於一些基質之動力常數(kinetic constants)，均無顯著差異，表示將天然木瓜酵素轉變?不溶性時，對於其構形(conformation)不會引起很大的變化。 五．?物的回收(recovery) 在反應混合物中的?物可利用有機溶劑抽取加以回收。在這過程中，必須在微鹼性的條件下(PH 9)處理，但由此可能會引起右旋異構物酯類輕微的皂化(Saponification)。所以，我們嚐試使用電透析(electrodialysis)的方法來達到此目的。電透析對於無機鹽類的純化，胺基酸的分離以及蛋白質之脫鹽?有相當好的效果。但在我們使用的過程中所用的離子交換膜對有機離子之通透性相當差，所以並沒有太大的進展。 六．展望 利用離子鍵結合來固定木瓜酵素，我們已有詳盡的探討。利用柱層形式(column form)操作相當方便。但在離子鍵結合的固定化中，有許多潛在的缺點。例如，蛋白質的流失(leakage)以及受到環境離子強度的限制等。所以必須同時探究其他形式固定化，以選擇出一種最適合大量製備具光學活性醯基胺基酸的方法。

Immobilization of papain was investigated by ionically Lnding the enzyme to ion exchange resin. Among the resins creened, CM-32 cellulose was chosen to obtain water-insoluble apain complex. Methanol had favorable effect or binding apacity if its concentration was below 40. For the enzyme assay of esterase activity, we used HPLC substitute the conventional pH-stat method. Some enzymatic properties of the immobilized enzyme were avestigated, and compared with those of native enzyme: 1. The papain-CNC complex gave a extremely high esterase activity and a low proteolytic activity. 2. The optimal pH of the immobilized enzyme was shifted by 1.5 pH units to the alkaline side in comparision with that of native enzyme. 3. The enzyme complex had less marked effects toward environmental changes - temperature and organic solvent than the native enzyme. 4. Both enzyme preparation had remarkable heat stability at 50℃. Toward N-acy1 amino acid methyl esters, these two enzyme reparations showed the same substrate specificity. Both enzymes possessed stereospecificity, and had no activity on amino acid methyl ester and Nps-amino acid-methyl ester. No marked difference of kinetic constants for several substrates was observed. Finally, we tried to use e1ectrodialysis to recover the desired product, and progressive study is still under investigation.