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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/73863
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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 吳蕙芬 | |
dc.contributor.author | Chia-Hui Lin | en |
dc.contributor.author | 林佳慧 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-17T08:12:12Z | - |
dc.date.available | 2024-08-20 | |
dc.date.copyright | 2019-08-20 | |
dc.date.issued | 2019 | |
dc.date.submitted | 2019-08-15 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/73863 | - |
dc.description.abstract | 本實驗室先前研究已經發現,Pseudomonas alcaligenes A25具有降解磷苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 [di(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP] 能力,此菌株能夠分泌胞外脂肪酶,在三丁酸甘油脂平板培養基上產生透化圈。透過選殖得到脂肪酶LipA,經過胺基酸序列比對建立親緣關係樹,確定LipA屬於Family1.I脂肪酶,需要Lif (lipase- specific foldase)幫助摺疊成具有活性的構型,單獨異源表現lipA會因為摺疊不完全導致蛋白質彼此聚集以不可溶形式存在包涵體中。因此利用異源共表達系統同時表現LipA以及LifB,在經過誘導以及純化後,得到可溶且具活性的LipA,由LipA基因序列轉譯成蛋白質序列,預測LipA蛋白質大小為35 kDa,序列比對得到活化位為Ser111,Asp257,His279其中Serine位在保守五胜肽序GHSHG上,和另外兩胺基酸殘基構成催化三元。由LifB基因序列轉譯成蛋白質序列,預測LifB蛋白質大小為38 kDa。針對LipA進行其他酵素特性分析,受質特異性測試分析結果顯示,相較於長碳鏈酯類,LipA偏好分解短碳鏈酯類,尤其以pNPC2(p-nitrophenyl acetate) 為受質時水解能力最佳,因此判斷其為酯解酵素 (3.1.1.1)。LipA反應溫度非常廣泛,溫度範圍在40~70℃下進行反應都具有良好活性,在溫度50℃有最大相對活性。其最適反應溫度為50℃,最適反應pH值為8。穩定性測試方面,在20℃以及pH 8條件下能維持良好活性。對於大部分金屬離子耐受性佳,重金屬Zn2+對酵素活性抑制較為顯著,非離子型介面活性劑Brij 35對酵素活性有提升效果,離子型介面活性劑Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 則會抑制酵素活性。多數有機溶劑對酵素活性有不同程度抑制,僅有ethanol對酵素活性影響較小,其中以chloroform以及isopropanol對活性抑制最為顯著。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Pseudomonas alcaligenes A25 was firstly selected for its capable of degrading DEHP. This bacterial strain also could secret extracellular lipases, grown on tributyrin agar plate with surrounded transparent zone. In this study, Pseudomonas alcaligenes A25 lipA+ gene was cloned and its encoded protein was referred to the phylogenetic tree analysis. As results, LipA belongs to lipase family 1.I, which needs a lipase specific foldase to fold itself into an active structure. LipA was folded incompletely when it was expressed alone. Therefore, it was aggregated and formed insoluble inclusion body. However, soluble and active LipA was obtained by simutaneously expressing LipA and LifB (lipase specific foldase) in bacterial cells. LipA was about 35 kDa and LifB was about 38 kDa. By amino-acid sequence alignment, an active site, Ser111, Asp257 and His279 were revealed in LipA. Ser 111 was in the conserved site, GHSHG; the disulfide bond which formed by Cys 213 and Cys 219, stabilizes its structure. In degradation assay, LipA prefered to degrade short chain p-nitrophenyl esters. Especially, LipA degrades pNPC2 (p-nitrophenyl acetate) efficiently. Therefore, LipA belongs to the esterase family (3.1.1.1). The optimal temperature for LipA activity is wide; it matains a higher activity beTween 40℃ and 70℃. Specifically, it had the highest activity at 50℃. An optimal pH for LipA activity was pH 8. LipA retains its most stability at pH 8 and 20℃. In addition, LipA could tolerate most of the metal ions used in the assays. However, its enzymatic activity was inhibited by a heavy metal ion, Zn2+. Furthermore, its enzymatic activity was elevated by nonionic-surfactants, Brij 35, but it was inhibited by ionic-surfantant, SDS. Similarly, the enzymatic activity of LipA was inhibited by most organic solvents. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-17T08:12:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-108-R06623021-1.pdf: 8222035 bytes, checksum: 5f151469c8ea74e5cdd6ad8fdc3112fe (MD5) Previous issue date: 2019 | en |
dc.description.tableofcontents | 中文摘要 i
ABSTRACT ii 目錄 iii 圖目錄 vii 表目錄 viii 附錄目錄 ix 壹、緒論 1 一、研究背景 1 二、研究動機與目的 3 三、研究方向 3 貳、文獻回顧 4 一、酯酶(esterase)與脂肪分解酶(lipase) 4 二、酯酶與脂肪酶立體結構 4 1.脂肪酶摺疊 5 2.脂肪酶構造 6 三、脂肪酶催化機制 8 四、脂肪酶種類 10 1.依據特異性分類 10 2.依據來源分類 11 五、脂肪酶催化的化學反應 15 1.水解 15 2.酯化 15 3.轉酯化 15 六、Pseudomonas 來源的脂肪酶 16 1. Pseudomonas脂肪酶分類 16 2. Pseudomonas脂肪酶特性 17 3. Pseudomonas脂肪酶應用 19 七、脂肪酶與其摺疊酶之間關聯 21 1.折疊酶 21 2.熱力學上的蛋白質折疊 21 3.脂肪酶與折疊酶分泌機制 22 4.摺疊酶—脂肪酶複合體結構 23 5.摺疊酶分類 25 八、酯酶及脂肪酶的應用 27 1.脂肪酶在清潔劑產業中應用 27 2.脂肪酶在生物柴油製造的應用 29 3.脂肪酶在農用化學品製造上的應用 30 4.脂肪酶在皮革製造的應用 31 5.脂肪酶在化妝品及香水工業上的應用 31 6.脂肪酶及酯酶在生物復育以及廢水處理的應用 31 7.脂肪酶及酯酶在食品工業中的應用 33 8.脂肪酶及酯酶在製藥及醫療上的應用 35 9.脂肪酶及酯酶在紙漿造紙及脫墨工業應用 37 參、材料與方法 38 一、實驗器材 38 1.藥品、試劑及相關套組 38 2.培養基 38 3.使用菌種 38 4.器材設備 39 5.分析軟體 39 二、可降解油類之菌種來源及篩選降解基因建構轉殖菌株 39 1.菌種來源 39 2.初步篩選可降解油類菌株 39 3.抽取染色體DNA 40 4.聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR) 40 5.DNA 瓊脂膠體電泳 40 6.純化PCR產物 41 7.萃取質體DNA 41 8.限制酶截切作用 41 9.接合作用 42 10.轉形作用(Transformation) 42 11.轉殖質體的篩選與確認 42 三、蛋白質分析 42 1.親緣關係樹建立 42 2.目標蛋白立體構型模擬 43 3.重組蛋白質誘導表現 44 4.目標蛋白質純化 44 5.十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 44 6.目標蛋白質透析濃縮 45 7.蛋白質定量 45 四、脂肪酶性質測定 45 1.脂肪酶酵素活性測定方法 45 2.脂肪酶基質特異性及酵素動力學試驗 46 3.溫度對脂肪酶活性及熱穩定性影響 46 4.pH值對脂肪酶活性及穩定性影響 46 5.陽離子對脂肪酶活性影響 47 6.多種試劑對脂肪酶活性影響 47 7.有機溶劑對脂肪酶活性影響 47 肆、結果與討論 48 一、Pseudomonas alcaligenes A25基因分析 48 1.脂肪酶基因以及摺疊酶基因序列分析 48 二、LipA蛋白質序列分析 48 1.與Pseudomonas來源脂肪酶親緣關係樹 48 2.LipA立體構造預測 49 三、LifB蛋白質序列分析 49 1.與細菌來源其他脂肪酶摺疊酶親緣關係樹 49 2.LifB立體結構預測 50 四、LipA酵素特性分析 50 1.以SDS-PAGE分析重組蛋白誘導表現及純化結果 50 2.脂肪酶基質特異性及酵素動力學試驗 51 3.溫度對脂肪酶活性及熱穩定性影響 52 4.pH值對脂肪酶活性及穩定性影響 52 5.陽離子對脂肪酶活性影響 53 6.多種試劑對脂肪酶活性影響 54 7.有機溶劑對脂肪酶活性影響 55 伍、綜合討論 57 陸、結論 61 柒、參考文獻 62 捌、圖表集 76 玖、附錄 103 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 產鹼假單胞菌A25之LipA純化與特性分析 | zh_TW |
dc.title | Purification and characterization of LipA from Pseudomonas alcaligenes A25 | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 107-2 | |
dc.description.degree | 碩士 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 徐駿森,林乃君,羅凱尹,陳昭瑩 | |
dc.subject.keyword | 假單孢菌屬,脂肪?,酯?,摺疊?,包涵體, | zh_TW |
dc.subject.keyword | Pseudomonas alcaligenes,lipase,esterase,foldase,inclusion body, | en |
dc.relation.page | 106 | |
dc.identifier.doi | 10.6342/NTU201903519 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2019-08-15 | |
dc.contributor.author-college | 生物資源暨農學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 農業化學研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 農業化學系 |
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