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| DC 欄位 | 值 | 語言 |
|---|---|---|
| dc.contributor.advisor | 王金和(Ching-Ho Wang) | |
| dc.contributor.author | Meng-Fang Hsu | en |
| dc.contributor.author | 許萌芳 | zh_TW |
| dc.date.accessioned | 2021-06-16T23:56:30Z | - |
| dc.date.available | 2017-07-27 | |
| dc.date.copyright | 2012-07-27 | |
| dc.date.issued | 2012 | |
| dc.date.submitted | 2012-07-18 | |
| dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/65654 | - |
| dc.description.abstract | 家禽白血病病毒（avian leukosis virus, ALV）為雞隻感染引起腫瘤性疾病之病原，在現場因使雞隻產能下降或淘汰增加造成經濟損失。目前市面上家禽白血病A亞群（subgroup A avian leukosis virus, ALV-A）使用全病毒塗鍍作為血清抗體之檢測方式，易因其他亞群抗體而造成檢測之敏感性與特異性不佳。本研究之目的為利用桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統進行ALV-A之表面醣蛋白gp85真核表現，並評估此真核表現重組蛋白質應用於免疫酵素連結吸附法之發展潛力。以台灣分離株TW-3577做為表現模板進行gp85基因之表現，建構帶有全段gp85基因的rgp85-baculovirus和全段gp85基因與前導序列之rgp85sp-baculovirus重組桿狀病毒進行Sf9昆蟲細胞之感染。收取重組桿狀病毒感染後之昆蟲細胞，進行西方墨點法分析可偵測到符合預期大小約75 kDa位置之重組gp85蛋白。重組桿狀病毒感染之昆蟲細胞使用間接型免疫螢光染色法也同樣可偵測到重組gp85蛋白之表現。感染72小時之昆蟲細胞cell pellet經lysis後直接做為塗鍍抗原，與標準陽性和陰性血清進行ELISA初測試，確認ALV-A抗血清可造成ELISA讀值之明顯上升，SPF雞隻血清則否。最佳化之ELISA條件使用72個田間樣本血清進行測試，以血清中和試驗做為抗體檢測金標準，得到ELISA之敏感性為80％，特異性為83.3％。利用桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統進行之ALV-A gp85蛋白表現，由於重組蛋白無法純化，ELISA之敏感性和特異性略顯不佳，若能成功進行大量蛋白質表現與純化，將可能增加其發展潛力。 | zh_TW |
| dc.description.abstract | Avian leukosis viruses, ALVs are the pathogens of neoplastic diseases in chickens, the reproductive reduction and increased elimination may cause the economic loss of chicken flocks. The commercial available subgroup A avian leukosis virus (ALV-A) antibody (Ab) detection kit coated with whole virus may decrease the sensitivity and specificity because of the interfering of Ab from other subgroups. The purpose of the study is using baculovirus/ insect cells expression system to express ALV-A surface glycoprotein (gp85), and to evaluate the potential of the recombinant protein to be used as the antigen in enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Using the laboratory isolate TW-3577 as the cloning template, two recombinant baculoviruses, rgp85-baculovrius and rgp85sp-baculovirus were constructed and infect the Sf9 insect cells. The infected insect cells showed positive result of recombinant gp85 proteins in Western blotting, the target protein size were about 75 kDa. In the indirect immunofluorescence assay, recombinant baculovirus infected insect cell showed positive results reacted with anti-His mAb and ALV-A antiserum. The cell pellet which harvested at 72 hours post infection was lysed, sonicated, and directly used as the coated antigen. 72 field sera were collected to test the optimized ELISA reaction. Using virus neutralization test as the gold standard, the sensitivity and the sepecificity of the rgp85sp ELISA were 80% and 83.3%, respectively. Both values were not good enough for future test due to the impurity of the expressed protein. The purity of the expression protein should be enhanced for future development of this test. | en |
| dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-16T23:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-101-R99629010-1.pdf: 1926052 bytes, checksum: e729dacce9511aef3a93b3562d517855 (MD5) Previous issue date: 2012 | en |
| dc.description.tableofcontents | 誌謝.......................................................i
目錄......................................................ii 表次......................................................vi 圖次.....................................................vii 中文摘要..................................................ix 英文摘要...................................................x 第一章 序言.............................................1 第二章 文獻回顧.........................................3 第一節 歷史背景與簡介...................................3 第二節 病毒特性與型態...................................4 第三節 病毒結構與功能...................................4 2-3.1 病毒基因體.........................................4 2-3.2 病毒蛋白質.........................................5 第四節 病毒複製.........................................6 2-4.1 形成provirus.......................................6 2-4.2 病毒的轉錄與轉譯...................................7 2-4.3 病毒核酸重組.......................................7 第五節 家禽白血病病毒亞群分類...........................8 2-5.1 病毒抗原性.........................................8 2-5.2 病毒分子特性.......................................8 第六節 宿主.............................................9 第七節 傳播途徑.........................................9 2-7.1 外源性病毒.........................................9 2-7.2 內源性病毒........................................10 第八節 臨床症狀與病理變化..............................11 2.8-1 潛伏期............................................11 2-8.2 臨床症狀..........................................12 2-8.3 病理變化..........................................12 2-8.4 免疫反應..........................................13 第九節 診斷方式........................................14 2-9.1 病毒分離..........................................14 2-9.2 分子生物學診斷....................................14 2-9.3 血清學診斷........................................15 第十節 流行病學........................................15 2-10.1 發生率...........................................15 2-10.2 台灣地區情形.....................................16 第十一節 感狀病毒蛋白質表現系統...........................16 2-11.1 蛋白質表現系統...................................16 2-11.2 桿狀病毒分類與構造...............................17 2-11.3 桿狀病毒基因表現.................................18 2-11.4 轉譯後蛋白質醣基化...............................19 第三章 材料與方法......................................21 第一節 ALV-A病毒中和試驗...............................21 3-1.1 材料來源..........................................21 3-1.2 病毒力價測定......................................21 3-1.2.1 細胞培養........................................21 3-1.2.2 計算細胞數目....................................22 3-1.2.3 病毒增殖........................................22 3-1.2.4 接種病毒........................................23 3-1.2.5 聚合酶鏈鎖反應（PCR）...........................23 3-1.2.6 計算病毒力價....................................23 3-1.3 血清中和試驗......................................24 3-1.3.1 中和反應........................................24 第二節 A亞群特異性基因建構.............................24 3-2.1 A亞群特異性基因序列的選取.........................24 3-2.2 A亞群特異性基因的製備.............................25 3-2.2.1 病毒RNA萃取.....................................25 3-2.2.2 反轉錄反應（RT）................................25 3-2.2.3 聚合酶鏈鎖反應（PCR）...........................26 3-2.2.4 電泳分析........................................27 3-2.2.5 特異性基因產物純化..............................27 3-2.3 A亞群特異性基因產物之基因選殖.....................28 3-2.3.1 TA接合反應......................................28 3-2.3.2 質體DNA細菌轉型.................................28 第三節 建構重組病毒與重組蛋白質之表現..................29 3-3.1 昆蟲細胞與桿狀病毒................................29 3-3.2 重組桿狀病毒之製備................................29 3-3.2.1建構重組pFastBacHT-rgp85和pFastBacHT-rgp85sp之質體 .................................................30 3-3.2.2 重組Bacmid之生成................................30 3-3.2.3 萃取rgp85-bacmid和rgp85sp-bacmid................32 3-3.2.4 rgp85-baculovirus、rgp85sp-baculovirus重組病毒之製 備..............................................32 3-3.3 重組蛋白表現最佳化與純化..........................33 3-3.3.1 重組蛋白表現最佳化..............................33 3-3.3.2 重組蛋白純化....................................33 3-3.3.3 SDS-PAGE與Westrn blotting分析...................34 3-3.4 間接型免疫螢光染色法（IFA）.......................35 第四節 酵素連結免疫吸附法之應用........................36 3-4.1 介紹偵測抗體的間接型ELISA（indirect ELISA）.......36 3-4.2 塗鍍重組封套蛋白之間接型ELISA.....................36 3-4.2.1 檢視商品化多株抗體與重組蛋白之結合能力..........36 3-4.2.2 最佳化間接型ELISA之條件.........................37 3-4.3 分析塗鍍重組蛋白rgp85sp之indirect ELISA之敏感性與特 異性.............................................37 3-4.3.1 indirect ELISA操作流程..........................37 3-4.3.2 indirect ELISA cut-off值分析....................38 3-4.3.3 ROC決定最佳敏感度與特異度之方法.................38 3-4.3.4 敏感性與特異性之計算............................38 3-4.4 indirect ELISA與不同亞群抗血清之特異性反應........38 第四章 結果 第一節 ALV-A 病毒中和試驗..............................39 4-1.1 病毒增殖..........................................39 4-1.2 病毒力價測定......................................39 4.2 以田間血清進行中和試驗..............................39 第二節 A亞群特異性基因建構.............................39 4-2.1 A亞群特異性基因之選取.............................39 4.2.2 A亞群特異性基因的製備.............................40 第三節 建構重組病毒與重組蛋白之表現....................40 4-3.1 重組pFastBacHT-rgp85和pFastBacHT-rgp85sp真核表現質體 建構..............................................40 4-3.2 重組rgp85、rgp85sp桿狀病毒製備....................40 4-3.3 西方墨點法分析重組蛋白之表現......................41 4-3.4 重組蛋白質表現條件最佳化..........................42 4-3.5 重組蛋白質純化....................................42 4-3.6 間接型免疫螢光染色法（IFA）.......................42 第四節 酵素連結免疫吸附法之應用........................43 4-4.1 檢視商品化多株抗體與重組蛋白之結合能力............43 4-4.2 以中和試驗做為金標準比較indirect ELISA之敏感性與特異 性................................................43 4-4.2.1 indirect ELISA之cut-off值計算...................43 4-4.2.2 以ROC curve畫出indirect ELISA最佳敏感性及特異性.43 4-4.2.3 indirect ELISA之敏感性特異性分析................44 4-4.3 indirect ELISA與不同亞群抗血清之特異性反應........44 第五章 討論............................................45 第六章 參考文獻........................................53 表次 表一、本論文所使用之特異性引子............................71 表二、進行中和試驗之血清樣本來源..........................72 表三、以血清樣本畫出ROC curve並計算indirect ELISA cut-off value...............................................73 表四、比較兩種不同計算indirect ELISA cut-off值差異........74 圖次 圖一、ALV-A病毒增殖後，使用引子對（PA1/TWA）進行ALV-A provirus 之核酸增幅結果.............................75 圖二、A亞群特異性基因選取建構之簡圖.......................76 圖三、病毒上清液經萃取RNA進行RT-PCR之目標基因產物.........77 圖四、rgp85和rgp85sp基因片段與pFastBac HT載體進行接合反應 後，形成pFastBacHT-rgp85和pFastBacHT-rgp85sp質體....77 圖五、重組rgp85-bacmid、rgp85sp-bacimid菌株之確認.........78 圖六、偵測感染Sf9昆蟲細胞中，重組病毒複製情形，並利用病毒斑 試驗純化單一重組病毒................................79 圖七、利用西方墨點法分析重組蛋白之表現情形................80 圖八、利用MOI＝0.1，感染時間進行重組蛋白質之最佳化條件建立81 圖九、利用His GravTrap affinity column進行重組蛋白之純化，並 進行SDS-PAGE和西方墨點法分析........................82 圖十、間接型免疫螢光染色法................................83 圖十一、以棋盤格方式找出最適合之indirect ELISA條件........84 圖十二、以Receiver operating characteristic curve （ROC curve）畫出indirect ELISA最佳敏感性及特異性.......85 圖十三、indirect ELISA之敏感性分析........................86 圖十四、indirect ELISA之特異性分析........................87 圖十五、重組蛋白與不同亞群抗血清特異性分析................88 圖十六、ALV TW-3577與各亞群ALVs之gp85推測胺基酸序列進行排列 與比對分析........................................89 附錄 Appendix 1. 比較雞隻血清、血漿樣本和週齡與ALV抗體盛行率...90 Appendix 2. 土雞場採集之基本資料與PCR和ELISA檢測結果......92 Appendix 3. 以大腸桿菌原核表現系統表現rgp85sp蛋白質.......93 Appendix 4. PET32b-rgp85sp重組蛋白以不同濃度urea回溶之確認94 | |
| dc.language.iso | zh-TW | |
| dc.subject | 真核表現 | zh_TW |
| dc.subject | 家禽白血病病毒 | zh_TW |
| dc.subject | 家禽白血病A亞群 | zh_TW |
| dc.subject | 外源性病毒 | zh_TW |
| dc.subject | 封套gp85醣蛋白 | zh_TW |
| dc.subject | 桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統 | zh_TW |
| dc.subject | 免疫酵素連結吸附法(ELISA) | zh_TW |
| dc.subject | eukaryotic expression | en |
| dc.subject | avian leukosis virus | en |
| dc.subject | enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) | en |
| dc.subject | subgroup A avian leukosis virus | en |
| dc.subject | exogenous viruses | en |
| dc.subject | env-gp85 glycoprotein | en |
| dc.subject | baculovirus/insect cell expression system | en |
| dc.title | 家禽白血病A亞群gp85蛋白質表現與抗體檢測之應用 | zh_TW |
| dc.title | Expression of recombinant subgroup A avian leukosis virus gp85 and its application as a diagnostic antigen for antibody detection | en |
| dc.type | Thesis | |
| dc.date.schoolyear | 100-2 | |
| dc.description.degree | 碩士 | |
| dc.contributor.oralexamcommittee | 鄭益謙(Ivan-Chen Cheng),闕玲玲(Ling-Ling Chueh),陳秋麟(Chiou-Lin Chen) | |
| dc.subject.keyword | 家禽白血病病毒,家禽白血病A亞群,外源性病毒,封套gp85醣蛋白,真核表現,桿狀病毒/昆蟲細胞表現系統,免疫酵素連結吸附法(ELISA), | zh_TW |
| dc.subject.keyword | avian leukosis virus,subgroup A avian leukosis virus,exogenous viruses,env-gp85 glycoprotein,eukaryotic expression,baculovirus/insect cell expression system,enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), | en |
| dc.relation.page | 94 | |
| dc.rights.note | 有償授權 | |
| dc.date.accepted | 2012-07-18 | |
| dc.contributor.author-college | 獸醫專業學院 | zh_TW |
| dc.contributor.author-dept | 獸醫學研究所 | zh_TW |
| 顯示於系所單位： | 獸醫學系 | |
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