偵測登革病毒抗原之紙基檢測系統之開發

Abstract

本研究著重於發展以紙為基材的檢測系統，用來偵測登革病毒抗原(dengue virus antigen)。以紙為基材的微流體系統相較於傳統的微流體元件，有低元件製造成本以及方便操作等多項優勢，本研究將利用此優勢，使用噴蠟列印法(Wax printing method)製備酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay)所使用的96孔盤，並且在其上建立一個用來檢測第二型登革病毒(dengue virus type 2, DENV-2)抗原的檢測平台。本研究中所使用的登革病毒抗原分別為第二型登革病毒的第一型非結構蛋白(dengue virus type 2 nonstructural protein 1, NS-1)以及第二型登革病毒的外鞘蛋白(dengue virus type 2 E protein, E protein)，利用這兩種登革病毒特有的生物指標分子以及其抗體，進行以紙為基材的酵素免疫分析法，並且利用家用掃描機來記錄每次酵素呈色後的顏色深淺數值，便可以此數值來判斷樣品中登革病毒抗原的濃度。另一方面，本研究也將此登革病毒抗原以及抗體的組合，應用於以紙為基材的側邊流免疫檢測元件(lateral flow immunoassay device)中，利用有奈米金粒子結合的抗第二型登革病毒第一型非結構蛋白的抗體(anti-DENV-2 NS-1 immunoglobulin)，將可以在紙上進行第二型登革病毒抗原的快速篩檢。實驗結果顯示，在紙上進行酵素免疫分析法，在適當的清洗步驟下，能獲得較低的訊號背景值以及較高的檢測靈敏度。本研究中所開發的登革病毒抗原酵素免疫分析檢測系統的靈敏度可以達到1 (ng/ml)，並且可以使用肉眼就可以清楚分辨不同濃度的抗原在紙上所顯示的顏色。使用酵素結合之單株抗體(enzyme-conjugated monoclonal antibody)來進行第二型登革病毒外鞘蛋白的檢測，同樣可以獲得可由肉眼分辨的的顏色訊號，使我們可以快速的利用此技術定性上檢測病毒的外鞘蛋白。使用以紙為基材的酵素免疫分析平台，不論在登革病毒抗原的定性或是定量上，皆能有清晰且準確的檢測結果。

This research focused on the development of a low-cost, easy-to-handle, and robust approach to detect one of the deadly diseases in tropical medicine—dengue. To achieve this goal, we have developed a paper-based ELISA (P-ELISA) —a new, inexpensive, and easy-to-handle platform for biochemical analysis—to detect the dengue virus type 2 nonstructural protein 1 (DENV-2 NS-1) and E protein. We introduced a new paper fabrication method, called wax printing method, to fabricate the paper in a rapid and easy way. The wax printed on the paper will form a hydrophilic-hydrophobic boundary after reflowing the wax by heating. We use this wax printing technique to fabricate a 96-well plate on the filter paper to prepare a paper-based platform to do ELISA for detecting dengue antigen proteins. The current results indicated that paper-based sandwich ELISA was capable of detecting ~1 (ng/ml) of DENV-2 NS-1. Also, indirect ELISA for dengue virus type 2 envelope protein (DENV-2 E protein) gives a distinct color intensity even at one-hundred folds of VLP (virus-like particle solution) dilution. These promising results, we believe, have a wide range of potential applications such as the detections of various proteins or antigens associated with many tropical infectious diseases.