請用此 Handle URI 來引用此文件:
http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/61490
完整後設資料紀錄
DC 欄位 | 值 | 語言 |
---|---|---|
dc.contributor.advisor | 王金和(Ching-Ho Wang) | |
dc.contributor.author | Kuang-Yu Chen | en |
dc.contributor.author | 陳光瑜 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-16T13:04:08Z | - |
dc.date.available | 2023-08-01 | |
dc.date.copyright | 2013-08-07 | |
dc.date.issued | 2013 | |
dc.date.submitted | 2013-08-05 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/61490 | - |
dc.description.abstract | 檢測抗體為禽流感監測中重要且最常使用之方式,其中包括HI test及ELISA,但由於操作過程繁瑣,需要特殊儀器、試劑,僅適用於實驗室操作,無法應用於現場檢測。因此本研究目的在於建立一快速檢測方式以應用於現場簡便操作。免疫色層分析試片,又被稱為快篩,主要利用固定於硝基纖維膜上的抗原,以及帶有膠體金標示抗體的追蹤子所構成,並能以肉眼快速判讀結果。其中,利用桿狀病毒表現系統表現禽流感病毒之核蛋白,作為固定之抗原,此抗原可與血清中所有亞型之禽流感病毒核蛋白的特異性抗體結合;由於使用重組蛋白,而可降低全病毒於現場操作之風險。以150隻血清進行測試,並以HI test作為金標準,此重組核蛋白之免疫色層分析試片的敏感度為93.2%,特異度為87.5%。此外,以此重組蛋白建立之間接型ELISA測試166隻血清,敏感度為100%,特異度為96.6%。結果顯示本禽流感檢測套組可用於檢測至少H5及H6亞型之AI抗體,並且能在20分鐘內完成判讀,顯示其應用於現場快速檢測之潛力。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Detecting antibody is important and commonly used for AI surveillance, including the HI test and ELISA. However, most of them are time-consuming and require well-equipped laboratories with well-trained medical technicians. For these reasons, they are unsuitable for clinical practice. Hence, to develop a rapid diagnostic kit is the main purpose which can be performed by each person easily. The immunochromatographic strip, also called rapid test, is a membrane-based strip, using gold-labeled antibody as the tracer in order to easily interpret with naked-eye. We used recombinant nucleoprotein as the antigen which can capture the Abs against all AIV strains. The rNP protein was produced by baculovirus expression system which can reduce the risk of virus dissemination when working in the field. The sensitivity and specificity of the rapid strip were 93.2%, and 87.5%, respectively, based on HI test in 150 serum samples. We also developed an indirect NP-ELISA to detect 166 serum samples. The sensitive and specificity were 100% and 96.6%, respecitivelty based on HI test. The results showed this rapid diagnosis strip can detect at least H5 and H6 AI subtypes within 20 minutes, and that is suitable to apply in the field, to achieve quick surveillance purpose. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-16T13:04:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-102-R00629006-1.pdf: 2908719 bytes, checksum: 82359e86eaa2411206a2c12fc35f8ee1 (MD5) Previous issue date: 2013 | en |
dc.description.tableofcontents | 口試委員會審定書 i
致謝 ii 摘要 iii Abstract iv 目錄 v 表次 xi 圖次 xi 第一章 序言 1 第二章 文獻探討 3 第一節 家禽流行性感冒病毒歷史背景 3 第二節 家禽流行性感冒病毒之病原學 4 2-2.1 病毒分類 4 2-2.2 病毒命名 5 2-2.3 病毒型態結構 6 2-2.4 病毒基因體、蛋白質結構與其功能 6 2-2.5 病毒複製機制 13 2-2.6 病毒抗原之變異性 14 2-2.7 病毒病原性 15 2-2.8 病毒物理及化學特性 16 第三節 家禽流行性感冒病毒之流行病學 17 2-3.1 宿主範圍 17 2-3.2 病毒傳播 18 2-3.3 病毒感染機制 18 2-3.4 臨床症狀與病理變化 19 第四節 家禽流行性感冒病毒之實驗室診斷 20 2-4.1 病毒抗原檢測 20 2-4.1.1 病毒分離 20 2-4.1.2 瓊脂膠體免疫擴散法 20 2-4.1.3 血球凝集試驗 21 2-4.1.4 血球凝集抑制試驗、神經胺酸酶抑制試驗 21 2-4.1.5 病毒核酸偵測 22 2-4.1.6 病毒結構蛋白檢測 22 2-4.2 病毒抗體檢測 23 2-4.2.1 瓊脂膠體免疫擴散法 23 2-4.2.2 血球凝集抑制試驗 23 2-4.2-3 神經胺酸酶抑制試驗 24 2-4.2.4 酵素連結免疫吸附法 24 第五節 免疫色層分析試片 24 2-5.1 免疫色層分析試片介紹 24 2-5.2 免疫色層分析試片之標定物 26 2-5.3免疫色層分析試片之應用 27 2-5.4免疫色層分析試片之檢測分類 27 2-5.4.1 抗原檢測 27 2-5.4.2 抗體檢測 28 2-5.4.3 競爭型 28 第六節 桿狀病毒表現系統 28 2-6.1 桿狀病毒 28 2-6.2 桿狀病毒表現系統之特性 30 2-6.3 桿狀病毒表現系統之應用 30 第三章 材料與方法 31 第一節 病毒增殖、純化及力價測定 31 3-1.1 病毒來源 31 3-1.2 病毒增殖 31 3-1.3 病毒核酸檢測 32 3-1.3.1 病毒核酸萃取 32 3-1.3.2 H5及H6亞型反轉錄聚合酶鏈鎖反應 32 3-1.4 病毒力價測定 33 3-1.5 病毒濃縮 33 3-1.6 病毒純化 34 第二節 病毒重組蛋白之建構與表現 34 3-2.1 病毒NP基因增幅 34 3-2.1.1 病毒核酸萃取 34 3-2.1.2 引子設計 34 3-2.1.3 基因片段增幅 35 3-2.1.4 洋菜膠體電泳分析 36 3-2.1.5 基因片段純化 36 3-2.2 病毒NP基因選殖確認 37 3-2.2.1 TA接合反應 37 3-2.2.2 轉型作用 37 3-2.2.3 重組質體確認 37 3-2.2.4 重組質體定序 38 3-2.3 建構帶有NP基因桿狀重組病毒 38 3-2.3.1 引子設計 38 3-2.3.2 原核載體重組質體製備 39 3-2.3.3 桿狀病毒重組質體rNP-pFastBac-HT-C製備 40 3-2.3.4 重組rNP-Bacmid建構與確認 41 3-2.3.5 重組 rNP-Bacmid DNA萃取 42 3-2.3.6 重組 rNP-Bacmid DNA轉染作用 42 3-2.3.7 重組病毒rNP-baculovirus增殖與病毒力價測定 43 3-2.3.8 細胞培養液之重組桿狀病毒濃縮與純化 43 3-2.4 桿狀病毒重組蛋白質表現及確認 44 3-2.4.1 重組蛋白質表現及最佳化分析 44 3-2.4.2 重組蛋白質之電泳分析與確認 44 3-2.4.3 細胞粗萃取液之重組蛋白純化 45 3-2.4.4 蛋白質定量 46 3-2.4.5 間接型免疫螢光染色法 46 第三節 酵素連結免疫吸附法之應用 47 3-3.1 indirect NP-ELISA製備 47 3-3.2 indirect NP-ELISA 條件最佳化 48 3-3.3 indirect NP-ELISA cut-off值分析 48 3-3.4 indirect NP-ELISA 敏感度、特異度及一致性之分析 48 第四節 免疫色層分析試片之應用 49 3-4.1 tracer製備與免疫色層分析試片組裝 49 3-4.1.1 膠體金與抗體混合比例分析 49 3-4.1.2 tracer製備 49 3-4.1.3 免疫色層分析試片 50 3-4.2 免疫色層分析試片(rNP-ICS)條件最佳化 50 3-4.3 免疫色層分析試片(rNP-ICS)組裝與操作 50 3-4.4 rNP-ICS敏感度及特異度分析 51 3-4.5 rNP-ICS靈敏度分析 51 3-4.6 rNP-ICS特異性分析 51 3-4.7 rNP-ICS對於其他AI亞型抗體之偵測 52 3-4.8比較血清冷凍解凍後於rNP-ICS之差異 52 第五節 血清抗體檢測 52 3-5.1 血清樣本準備 52 3-5.2 血球凝集抑制試驗 52 3-5.3 商品化酵素連結免疫吸附法 53 第四章 結果 54 第一節 病毒增殖、純化及力價測定 54 4-1.1 病毒增殖 54 4-1.2 病毒力價測定 54 4-1.3 病毒濃縮純化 54 第二節 病毒重組蛋白之建構與表現 54 4-2.1 病毒NP基因增幅 54 4-2.2 病毒NP基因選殖確認 55 4-2.3 建構帶有NP基因桿狀重組病毒 55 4-2.3.2 原核載體重組質體製備 55 4-2.3.3 桿狀病毒重組質體rNP-pFastBac-HT-C製備 55 4-2.3.4 重組rNP-Bacmid建構與確認 55 4-2.3.5 重組病毒rNP-baculovirus製備 56 4-2.3.6 細胞培養液之重組桿狀病毒濃縮與純化 56 4-2.4 桿狀病毒重組蛋白質表現及確認 56 4-2.5 重組蛋白質表現最佳化分析 57 4-2.6 細胞粗萃取液之重組蛋白純化 57 4-2.7 間接型免疫螢光染色法 57 第三節 酵素連結免疫吸附法之應用 58 4-3.1 indirect NP-ELISA 抗原塗鍍濃度及血清稀釋倍數 58 4-3.2 indirect NP-ELISA cut-off值分析 58 4-3.3 indirect NP-ELISA 敏感度、特異度及一致性分析 59 4-3.4 以Receiver operating characteristic curve(ROC curve)分析indirect NP- ELISA之敏感度及特異度 59 第四節 免疫色層分析試片之應用 59 4-4.1 膠體金與抗體混合比例分析 59 4-4.2 免疫色層分析試片(rNP-ICS)條件最佳化 59 4-4.3 rNP-ICS敏感度及特異度及一致性分析 60 4-4.4 rNP-ICS靈敏度分析 60 4-4.5 rNP-ICS特異性分析 60 4-4.6 比較血清冷凍解凍後於rNP-ICS之差異 61 第五章 討論 62 參考文獻 69 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 家禽流行性感冒病毒核蛋白抗體之免疫色層分析試片開發 | zh_TW |
dc.title | Development of an Immuochromatographic Strip for Rapid Detection of Antibodies Against the Nucleoprotein of Avian Influenza Virus | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 101-2 | |
dc.description.degree | 碩士 | |
dc.contributor.coadvisor | 鄭益謙 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 謝快樂,沈瑞鴻,張伯俊 | |
dc.subject.keyword | 禽流感,免疫色層分析試片,膠體金,核蛋白,桿狀病毒表現系統,間接型ELISA, | zh_TW |
dc.subject.keyword | avian influenza virus,baculovirus,immunochromatographic strip,indirect ELISA,recombinant nucleoprotein, | en |
dc.relation.page | 114 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2013-08-05 | |
dc.contributor.author-college | 獸醫專業學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 獸醫學研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 獸醫學系 |
文件中的檔案:
檔案 | 大小 | 格式 | |
---|---|---|---|
ntu-102-1.pdf 目前未授權公開取用 | 2.84 MB | Adobe PDF |
系統中的文件,除了特別指名其著作權條款之外,均受到著作權保護,並且保留所有的權利。