在老鼠實驗利用氣管投予微小干擾核醣核酸，抑制流行性感冒病毒之PB2表現，並治療流行性感冒病毒感染

Abstract

研究背景： A 型流行性感冒病毒估計每年可感染全球人口的20 %，甚至可能因基因重組造成全球大流行。疫苗與抗病毒藥物目前是用來預防與治療A 型流行性感冒病毒的主要方式，然而因為病毒高突變率的特性，使得抗病毒藥物及疫苗仍有失效的可能，因此發展新的預防或治療方式是目前當務之急。 微小干擾核醣核酸(siRNA)是細胞用來調控核醣核酸的機制，使得一些核醣核酸不能夠執行其功能。而A 型流行性感冒病毒之基因片段中有一些長久保存不變的序列已執行重要的功能，這將是微小干擾核醣核酸理想的抑制目標。在本研究中，我們將構築一系列以DNA載體為基礎的短髮夾核醣核酸(shRNA)，並以polymerase III U6-RNA啟動子作控制，鎖定多個A型流行性感冒病毒的基因作為結合目標，以期在細胞實驗(in vitro)以及老鼠模式中得到預防流行性感冒病毒感染的效果。 研究方法： 本研究設計了八組以DNA載體為基礎的shRNA，其中四組shRNA的結合目標為聚合酶酸性蛋白(polymerase acidic protein)的基因，兩組shRNA的結合目標為聚合酶鹼性蛋白1(polymerase acidic protein 1, PB1)的基因，兩組shRNA的結合目標為聚合酶鹼性蛋白2(polymerase acidic protein 2, PB2)的基因，利用這八組shRNA分別進行in vitro試驗以及動物試驗(C57BL/6老鼠模式)，以檢測是否能有效抑制流行性感冒病毒A/WSN/33(H1N1)的感染。我們也在in vitro環境中，執行救援實驗(rescue experiment)，以證明shRNA沒有off-target effect。 動物實驗中，投予shRNA的方式是利用耳鏡窺器(otoscope specula)伸入氣管內傳送模式，將shRNA轉染至C57BL/6老鼠，並利用免疫組織化學染色法對質體在老鼠肺中作定位，確定活體轉染的成效。我們在轉染治療性shRNA後，等待24小時，然後接種A/WSN/33流行性感冒病毒，並每日記錄老鼠的體重。老鼠自然死亡或是14天進行安樂死後，取得其肺部組之測量流行性感冒病毒的效價。 研究結果： 從PA、PB1以及PB2基因中選擇了八條高度保留性序列(PA-sh1、PA-sh2、PA-sh3、PA-sh4、PB1-sh1、PB1-sh2、PB2-sh1、PB2-sh2)中，測試過5μg、10μg以及20μg的shRNA質體，僅在20μg的劑量下觀察到抑制效果，且只有其中三條shRNA質體(PA-sh1、PA-sh2、PB2-sh2) 的抑制效果較佳，在溶斑減少試驗(plaque reduction assays)的結果中，與控制組相比較，其抑制效果為5.3%、4.3%及4.5% (p<0.01)。 雖然在大部分的動物細胞中，shRNA並不會活化干擾素反應(interferon response)，但為了避免在免疫機制中交互作用，在劑量試驗(dose dependent test)中改以缺乏干擾素的Vero細胞當做宿主。在結果中顯示，不同重量的shRNA質體(1 μg、2.5 μg、5 μg、8 μg、10 μg、15 μg)，以劑量10 μg的shRNA質體，抑制單白質表現的效果最好，PA-sh1、PA-sh2、PB2-sh2對於PA蛋白分別有51%、57%、56%的抑制效果，對於PB2蛋白分別有51%、49%、37%的抑制效果，三條shRNA質體對於M蛋白也都有50%以上的抑制效果。在溶斑減少試驗(plaque reduction assays)的結果中，隨著shRNA質體重量的增加，抑制病毒的效果也隨之增加，其中以劑量8~10μg的效果為最佳。另一方面，以季節性流感(H1N1、H3N2)取代A/WSN/33(H1N1)來感染細胞，Western blots及plaque reduction assays的結果中，皆顯示shRNA質體對於目標基因的表現並沒有抑制效果。 在救援實驗(rescue experiment)中，由Western blots的結果可看出，shRNA質體對於wild type PA、PB2的蛋白表現，有非常明顯的抑制效果，相較之下，mutant type則沒有隨著shRNA質體量的增加，而產生抑制效果，此試驗證明shRNA排除off-target effect。 在動物實驗中，經過14天後，預先送入PB2sh2質體的老鼠，在感染A/WSN/33 (H1N1)後，有67%的存活率，預先送入PAsh1及PAsh2質體的老鼠，則分別有22%、33%的存活率，另一方面，預先送入GFP質體的對照組老鼠，則在感染A/WSN/33(H1N1)的十天後，全數死亡。 利用RT-PCR進行病毒效價的定量，預先送入shRNA質體的老鼠與對照組的老鼠相比較，病毒效價有明顯的降低，p-value皆小於0.05，在統計學上為有顯著意義。 結論： 在本實驗中，我們從PA，PB1，PB2找到三段in vitro有效抑制A型流行性感冒病毒的微小干擾核醣核酸序列，兩段在PA，一段在PB2。並且將這段微小干擾核醣核酸，設計shRNA的序列，嵌入載體plasmid，並且成功的in vitro在犬腎細胞(Madin-Darby canine kidney, MDCK)，非洲綠猴腎細胞(Vero cell lines)，抑制A型流行性感冒病毒(A/WSN/33 virus H1N1)的複製。我們也在293T細胞上，藉由救援實驗(rescue experiment)，證明三段shRNAs的抑制病毒效果並非off-target effect。藉由動物實驗，我們證明其中一段PB2-sh2微小干擾核醣核酸，可以降低A型流行性感冒病毒在小鼠(C57BL/6 mice)肺部的病毒複製，進而降低死亡率。

Background Influenza virus infection is a major threat to human health. Small interfering RNA (siRNA) is a promising approach for the prevention and treatment of viral infections. In this study, we constructed a series of DNA vector-based short hairpin RNAs (shRNAs) that target various genes of the influenza A virus using the polymerase III U6-RNA promoter to prevent influenza virus infection in vitro and in a mouse model. Results Three sets of DNA vector-based shRNA, two targeting genes encoding the polymerase acidic protein (PA) and one targeting polymerase basic protein 2 (PB2), efficiently inhibited the replication of influenza virus A/WSN/33(H1N1) in vitro. We also successfully prevented influenza virus A/WSN/33(H1N1) infection in a C57BL/6 mouse model by intratracheal delivery of anti-PB2 shRNA. Conclusions Our findings suggest that the PB2-targeting shRNA plasmid showed potential for use as an RNAi-based therapeutic for influenza virus infection.