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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 李佳音(Chia-Yin Lee) | |
dc.contributor.author | Yi-Jr Chen | en |
dc.contributor.author | 陳頤之 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-16T06:48:06Z | - |
dc.date.available | 2017-08-14 | |
dc.date.copyright | 2014-08-14 | |
dc.date.issued | 2014 | |
dc.date.submitted | 2014-07-25 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/57484 | - |
dc.description.abstract | 由微生物產生的中鏈聚羥基烷酸酯 (medium-chain-length Polyhydroxyalkanoates, MCL-PHAs) 柔韌有彈性,適合開發應用於軟組織工程或藥物傳輸等生醫材料。本研究針對一株中鏈PHA高產量生產菌Pseudomonas mosselii TO7之PHA合成代謝途徑進行探討。以0.5%辛酸為碳源,1 g/L之 (NH4)2SO4為氮源,培養基初始pH值為9,經一階段培養方式培養40小時後,所收獲P. mosselii TO7菌體具有最佳PHA產量,為菌體乾重45%以上,主要組成是聚羥基辛酸酯,於PHA比例高達 95%。利用廉價碳源棕櫚核仁油或大豆油生成中鏈聚羥基烷酸酯,由棕櫚核仁油產生的PHA結晶度較高。利用丙烯酸 (acrylic acid) 及2-溴正辛酸 (2-bromooctanoic acid)兩種抑制劑証實P. mosselii TO7主要由脂肪酸經β氧化途徑合成PHA,由醣類經脂肪酸生合成途徑僅能產生少量PHA。P. mosselii TO7 的PhaC1Pm為第二型PHA聚合酶,將P. mosselii TO7擁有的兩個PHA聚合酶基因,以PHA基因缺失株P. putida GPp104 PHA-分別進行PHA累積表現,顯示P. mosselii TO7利用八至十二碳脂肪酸為碳源時,主要作用酵素為PhaC1 Pm。(R)-立體特異性烯酰輔酶A水合酶於菌體內利用脂肪酸合成PHA為重要酵素之一,因此選殖出P. mosselii TO7 PHA (R)-立體特異性烯酰輔酶A水合酶 (phaJ4Pm),以phaJ4Pm分別於Escherichia coli LS5218利用十二烷酸為碳源,P. mosselii TO7利用辛酸為碳源,進行異源表現與過度表現,結果皆顯示PhaJ4Pm可提升PHA產量及PHA的八碳單體組成。以trans-2-octenoyl-CoA分析PhaJ4Pm的酵素活性,証實PhaJ4Pm 具有水合酶功能。令PhaJ4Pm與P. putida GPo1 PHA聚合酶1 (poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 1, PhaC1Pp) 進行偶合反應,証實經PhaJ4Pm催化之產物為R-specific。先前本研究室已知第二型PHA聚合酶PhaC1Pp之L 484位置可能為影響基質專一性的重要胺基酸。為闡明第二型PHA聚合酶影響基質專一性的重要胺基酸,本研究進行PhaC1Pp之L484位置飽和突變實驗,証實野生株leucine置換為valine時,對酵素基質專一性的改變最為明顯。以人類環氧化物水解酶 (epoxide hydrolase from Human) 為模板建立酵素3D模型,顯示出484位置上之胺基酸可能由於接近酵素催化殘基histidine 479而影響了PHA的合成。本研究探討P. mosselii TO7所生產中鏈聚羥基烷酸酯之特性及其合成代謝途徑中,PhaC1Pm,PhaC2Pm及PhaJ4Pm三酵素對PHA合成影響;並提供第二型PHA聚合酶PhaC1 Pp影響基質專一性重要胺基酸位置之分析。 | zh_TW |
dc.description.abstract | The properity of medium-chain-length polyhydroxyalkanoates (MCL-PHAs) possessing flexibility and elasticity are potentially used in cardiovascular, soft tissue engineering and drug delivery. This study investigated the PHA biosynthestic pathways of high-yield medium-chain-length PHAs producing strain Pseudomonas mosselii TO7. P. mosselii TO7 can produce PHA at a yield of more than 45% of its dry weight in mineral salt medium containing 0.5% octanoic acid and 1g/L (NH4)2SO4 after 40 hours incubation. The 3-hydroxyoctanoate monomer produced by shake flask cultivation in one stage made up 95% of the polymer composition. Initial culture medium pH level of 9 lead to increased PHA biosynthesis. P. mosselii TO7 can utilize palm kernel oil or soybean oil to produce PHA, however, using palm kernel oil having relatively higher crystallinity. The inhibitors studies including acrylic acid and 2-bromooctanoic acid indicated that β-oxidation of fatty acids is mainly used to synthesize PHA in P. mosselii TO7. Two class II PHA polymerase genes phaC1Pm and phaC2Pm of P. mosselii TO7 were heteroexpression in PHA-negative mutant P. putida GPp104 PHA-. The result demonstrated that when P. mosselii TO7 used 8-12 carbon fatty acids as a carbon source, the main enzyme was PhaC1Pm. The (R)-specific enoyl-CoA hydratase from P. mosselii TO7 (PhaJ4Pm) was identified, owing to (R)-specific enoyl-CoA hydratase play an important role for PHA biosynthesis from fatty acids in microorganism. Hetereoexpression of PhaJ4Pm in Escherichia coli LS5218 when feeding 12 carbon fatty acids, the result showed increased PHAs production and 3-hydroxyoctanoate monomer composition of PHA. Similar results also have appeared in P. mosselii TO7 when overexpression of PhaJ4Pm used 8 carbon fatty acids as a sole carbon source. Analysis of PhaJ4Pm enzyme activity using trans-2-octenoyl-CoA confirmed that PhaJ4Pm functions as a hydrase. A coupling reaction between PhaJ4Pm and PHA polymerase 1 from P. putida GPo1 (PhaC1Pp) displayed the PhaJ4-catalyzed products with R-specific stereospecificity. Our previous study indicated that class II PHA polymerase PhaC1Pp at mutation at L484V may affect the substrate specificity of enzyme. To explain substrate-specific related amino acid residue in class II PHA polymerase, PhaC1Pp was used. Saturation mutagenesis at residue leucine 484 in PhaC1Pp confirmed when the wild type leucine was switched with valine, a change in substrate-specificity was most significant. Constructing 3D enzyme models showed the amino acid residues at 481, 482, and 484 may influence PHA biosynthesis due to close to the enzyme catalytic residue His479. This study explores the characteristics of PHA produced from P. mosselii TO7, the effects of PhaC1Pm, PhaC2Pm and PhaJ4Pm on PHA biosynthesis, and providing analysis of substrate-specific related amino acid residue in a class II PHA polymerase PhaC1 Pp. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-16T06:48:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-103-D95623001-1.pdf: 4446853 bytes, checksum: fa7213f195ca8560ffa9cb63a0b3ec76 (MD5) Previous issue date: 2014 | en |
dc.description.tableofcontents | 目錄
謝誌 I 中文摘要 III 英文摘要 V 表次 XI 圖次 XII 附錄表次 XIV 附錄圖次 XIV 縮寫表 XV 第一章、 前言及文獻回顧 1 一. 前言 1 二. 文獻回顧 1 1. PHA的構造,性質及應用 1 2. 生合成PHA的菌種 3 3. PHA的生合成代謝途徑 5 4. PHA聚合酶的種類 7 5. PHA聚合酶中具有影響力的胺基酸位置 8 6. PHA聚合酶的可能催化機制 14 7. PHA之研究趨勢 15 第二章、 Pseudomonas mosselii TO7之中鏈聚羥基烷酸酯生產及其產物之鑑定 18 一. 本章摘要 18 二. 本章前言 18 三. 材料與方法 20 1. 菌株 20 2. 引子 20 3. 培養基 21 4. 藥品及試劑套組 22 5. 儀器 22 6. 生物資訊學網站 22 7. 菌株PHA累積簡易鑑定方法 22 8. 菌株脂質分解能力簡易鑑定方法- tributyrin plate assay 23 9. P. mosselii TO7革蘭氏染色法 23 10. P. mosselii TO7 16S rDNA基因選殖及定序方法 23 11. 菌株親緣關係分析方法 26 12. 菌種保存方法 26 13. 誘導P. mosselii TO7累積PHA 27 14. 收集PHA累積之菌體-冷凍乾燥法 27 15. PHA產量及單體組成測定-氣相層析儀分析法 28 16. PHA萃取方法-氯仿萃取 29 17. PHA結構鑑定方法-核磁共振儀分析 29 18. PHA分子量測定-凝膠滲透層析儀分析法 30 19. PHA熱性質測定-微差熱掃描分析儀分析法 30 20. 統計分析方法 30 四. 結果 31 1. P. mosselii TO7 PHA累積脂質分解能力分析結及革蘭氏染色結果 31 2. P. mosselii TO7以16S rDNA進行演化樹分析結果 31 3. P. mosselii TO7培養於不同碳源之PHA累積結果 32 4. P. mosselii TO7培養於不同條件之PHA累積結果 33 5. P. mosselii TO7之細胞生長與PHA累積間關係 34 6. PHA結構分析 34 7. PHA性質分析 35 五. 討論 35 六. 結論 38 第三章、 利用抑制劑及聚羥基烷酸酯聚合酶異源表現探討Pseudomonas mosselii TO7生產中鏈聚羥基烷酸酯合成途徑 39 一. 本章摘要 39 二. 本章前言 39 三. 材料與方法 41 1. 菌株與質體 41 2. 引子 41 3. 培養基 41 4. 藥品及試劑套組 41 5. 儀器 41 6. 生物資訊學網站 42 7. P. mosselii TO7使用PHA聚合酶途徑抑制劑累積PHA實驗方法 42 8. P. mosselii TO7 PHA合成途徑相關基因選殖 42 9. P. mosselii TO7 PHA聚合酶質體建構方法 43 10. 電衝轉形方法 44 11. 抽取質體DNA 45 12. P. mosselii TO7 PHA聚合酶異源表現之PHA累積方法 46 四. 結果 46 1. 代謝抑制劑對P. mosselii TO7 PHA累積的影響 46 2. P. mosselii TO7 PHA合成途徑相關基因選殖結果 47 3. P. mosselii TO7 PHA聚合酶異源表現 48 五. 討論 49 六. 結論 52 第四章、 (R)-立體特異性烯酰輔酶A水合酶對Pseudomonas mosselii TO7合成中鏈聚羥基烷酸酯的影響 54 一. 本章摘要 54 二. 本章前言 54 三. 材料與方法 56 1. 菌株與質體 56 2. 引子 57 3. 培養基 57 4. 藥品及試劑套組 57 5. 儀器 57 6. 生物資訊學網站 58 7. phaJPm基因選殖及質體建構 58 8. 誘導含重組質體E. coli LS5218及P. mosselii TO7累積PHA方法 60 9. trans-2-octenoyl CoA合成方法 60 10. trans-2-octenoyl CoA濃度測定方法 61 11. 胞內酵素粗抽液製備方法 62 12. Enoyl CoA hydratase酵素活性分析 62 13. R-specific立體特異性分析 63 14. PHA分子量測定 64 15. 統計分析 64 四. 結果 64 1. phaJPm基因選殖 64 2. PhaJ4Pm異源表現與過度表現之PHA產量及單體組成 67 3. 酵素活性分析基質trans-2-octenoyl-CoA合成 68 4. PhaJ4Pm enoyl CoA hydratase酵素活性分析條件測試 68 5. PhaJ4Pm enoyl CoA hydratase酵素活性分析 69 6. PhaJ4Pm R-specific立體特異性分析條件測試 69 7. PhaJ4Pm R-specific立體特異性分析 70 8. PhaJ4Pm異源表現及過度表現之PHA分子量測定 70 五. 討論 71 六. 結論 74 第五章、 第二型聚羥基烷酸酯聚合酶影響基質專一性之胺基酸殘基 75 一. 本章摘要 75 二. 本章前言 75 三. 材料與方法 76 1. 菌株與質體 76 2. 引子 77 3. 試劑套組 77 4. 生物資訊學網站 77 5. P. putida Gpo1之PHA聚合酶塑模方法 77 6. 定點飽和突變方法 77 四. 結果 79 1. P. putida Gpo1之PHA聚合酶塑模結果 79 2. P. putida Gpo1之PHA聚合酶L484飽和突變株建構 80 3. P. putida Gpo1之PHA聚合酶L484飽和突變異源表現 81 五. 討論 82 六. 結論 83 第六章、 總結 85 第七章、 未來展望 88 參考文獻 91 表次 表1-1. 以細菌工業化生產PHA及其應用 129 表2-1. 本實驗所使用之藥品及試劑套組 131 表2-2. 本實驗所使用之儀器 133 表2-3. P. mosselii TO7親緣關係分析菌種資料 135 表2-4. P. mosselii TO7利用不同碳源累積PHA 136 表2-5. P. mosselii TO7於不同條件下累積 PHA 137 表2-6. P. mosselii TO7不同培養時間累積PHA結果 138 表2-7. P. mosselii 產生PHA分子量與他菌之比較 139 表3-1. 本實驗所使用之菌株及質體 140 表3-2. 本實驗所使用之引子 141 表3-3. 本實驗所使用之藥品及試劑套組 142 表3-4. P. mosselii TO7使用PHA合成途徑抑制劑累積PHA實驗結果 143 表3-5. P. mosselii TO7 PHA聚合酶異源表現於不同pH累積PHA結果 144 表3-6. P. mosselii TO7 PHA聚合酶異源表現之PHA累積結果 145 表3-7. P. mosselii TO7合成相關基因與其他菌株類似基因比對結果 146 表4-1. 本實驗所使用之菌株與質體 149 表4-2. 本實驗所使用之引子 150 表4-3. 本實驗所使用之藥品及試劑套組 151 表4-4. phaJ4Pm核苷酸序列經BLAST分析結果 152 表4-5. PhaJ4Pm胺基酸序列經BLAST分析結果 153 表4-6. P. mosselii TO7利用phaJ1pm-F及phaJ1pm-R 選殖之序列經ORF FINDER分析結果 154 表4-7. P. entomophila L48與不同菌種PHAJ之同源蛋白質 155 表4-8. P. mosselii SJ10與不同菌種PhaJ之同源蛋白質 156 表5-1. 本實驗所使用之菌株與質體 157 表5-2. 本實驗所使用之引子 159 表5-3. P. putida及E. coli密碼使用頻率 160 表5-4. PhaC1PP與已知結構蛋白質序列之比對結果 162 表5-5. PhaC1PP 與已知結構蛋白質序列之二級結構比對結果 163 表5-6. P. putida Gpo1 PHA聚合酶L484飽和突變之PHA累積結果 164 圖次 圖1-1. 細菌產生的PHA結構 165 圖1-2. 四種PHA聚合酶胺基酸序列之一級序列比對 172 圖1-3. 四種PHA聚合酶胺基酸序列之一級序列比對彙總 173 圖2-1. P. mosselii TO7累積PHA簡易鑑定脂解能力分析及革蘭氏染色結果 174 圖2-2. P. mosselii TO7之16S rDNA PCR電泳圖及1,457 bp定序結果 175 圖2-3. P. mosselii TO7以16S rDNA進行演化樹分析結果 176 圖2-4. P. mosselii TO7所產MCL-PHA之13C NMR圖譜 177 圖2-5. P. mosselii TO7所產MCL-PHA之分子量分析 178 圖2-6. P. mosselii TO7 利用植物油產生PHA微差熱掃描分析圖譜 179 圖2-7. P. mosselii TO7於本研究所使用碳源 180 圖3-1. P. mosselii TO7 PHA合成相關基因以PCR增幅之電泳圖 181 圖3-2. phaZPm基因核苷酸序列及胺基酸序列 182 圖3-3. phaGPm基因核苷酸序列及胺基酸序列 183 圖3-4. P. mosselii TO7 PHA聚合酶及分解酶基因座及引子相對位置 184 圖3-5. 建構選殖質體pBSK-phaC1pm 及pBSK-phaC2pm 185 圖3-6. 建構廣宿主質體pBBR-PhaC1pm 及pBBR-PhaC2pm 186 圖3-7. P. mosselii TO7 PHA聚合酶選殖質體及廣宿主質體電泳圖 187 圖3-8. P. mosselii TO7 PHA聚合酶異源表現之PHA累積結果圖 188 圖3-9. P. entomophila L48 PHA合成相關基因 189 圖3-10. P. mosselii TO7於本研究所確立之代謝途徑及選殖基因圖 190 圖4-1. 由P. mosselii TO7 以PCR選殖之phaJPm電泳圖 191 圖4-2. phaJ4Pm基因核苷酸序列及胺基酸序列 192 圖4-3. 由P. mosselii TO7染色體利用phaJ1pm-F及phaJ1pm-R 選殖之序列分析 193 圖4-4. P. entomophila L48 enoyl-CoA hydratase, R-specific,P. putida KT2440之PhaJ1與P. mosselii SJ10之3-hydroxybutyryl-COA dehydratase之核苷酸序列比對 194 圖4-5. P. putida的phaJ1核苷酸序列與其他19條核苷酸序列115 – 134位置比對及設計之primer phaJ1-116-133 195 圖4-6. 由P. mosselii TO7及P. putida GPp104 PHA-以PCR選殖之phaJ4電泳圖 196 圖4-7. 建構選殖質體 T-PhaJ1pm及T-PhaJ4pm 197 圖4-8. 建構廣宿主質體 pBBRphaJ4pm 198 圖4-9. 建構廣宿主質體 pBBRphaC1ppJ4pm 199 圖4-10. PhaJ4Pm異源表現與過度表現之PHA產量及單體組成結果 200 圖4-11. phaJ4Pm質體定量圖 201 圖4-12. PhaJ4Pm於E. coli LS5218異源表現蛋白質定量結果 202 圖4-13. Enoyl-CoA hydratase活性分析之吸光值變化 205 圖4-14. PhaJ4Pm之enoyl-CoA hydratase酵素活性分析結果 206 圖4-15. Enoyl-CoA HYDRATASE與PHA synthase行偶合反應之吸光值變化 209 圖4-16. PhaJ4Pm之R-Specific hydratase立體特異性分析結果 210 圖4-17. PhaJ4Pm異源表現之PHA分子量測定結果 211 圖4-18. PhaJ4Pm過度表現之PHA分子量測定結果 212 圖4-19. PhaJ1pe及P. entrompophila之putative MaoC-like dehydratase之序列比對 213 圖4-20. P. mosselii TO7於本研究所確認代謝途徑酵素及選殖基因 214 圖5-1. PHA聚合酶PhaC1PP 預測二級結構圖示 215 圖5-2. PHA聚合酶PhaC1PP 與1ZD3的結構比對 216 圖5-3. 模擬之PhaC1PP 活化中心結構圖 217 圖5-4. P. putida GPp104之PHA聚合酶野生株及L484飽和突變株利用基因定序確認突變株序列結果 219 圖5-5. 不同類型PHA聚合酶胺基酸序列之一級序列部分比對 221 附錄表次 附錄表一. PHA與其他聚合物特性之比較 . 223 附錄表二. 可代替各類型石化塑膠的商業化PHA . 224 附錄表三. 各菌種保存中心之生產PHA菌種. 225 附錄表四. 各種不同單體組成的PHA. 233 附錄表五. Pseudomonas菌屬生產之中鏈PHA種類及性質. 234 附錄表六. 各種PHA生產菌PhaJ的基質專一性. 236 附錄表七. 二十種胺基酸之疏水性指數. 237 附錄圖次 附錄圖一. 細菌PHA生合成途徑. 238 附錄圖二. PHA聚合酶催化之反應與四種PHA聚合酶的分類 239 附錄圖三. 四種PHA聚合酶基因座組成. 240 附錄圖四. 四種 PHA 聚合酶的結構模型 241 附錄圖五. 第一及第三型PHA聚合酶催化PHA合成推論機制 242 附錄圖六. 第二型PHA聚合酶雙體催化P(3-HHX)合成推論機制 243 附錄圖七. PHA生合成代謝路徑抑制劑作用位置 244 附錄圖八. phaC1Pm基因核苷酸序列及胺基酸序列 245 附錄圖九. phaC2Pm基因核苷酸序列及胺基酸序列 246 附錄圖十. 基質trans-2-octenoyl-CoA濃度測定 247 附錄圖十一. Enoyl-CoA hydratase酵素活性及R-specific立體特異性反應 248 附錄圖十二. E. coli LS5218與P. mosselii TO7之PHA生合成代謝途徑簡圖 249 附錄圖十三. QuikChangeR II XL Site-Directed Mutagenesis Kit定點突變方法概觀 250 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | Pseudomonas mosselii TO7生產聚羥基烷酸酯及其合成途徑之研究 | zh_TW |
dc.title | The polyhydroxyalkanoates and its biosynthesis pathway of Pseudomonas mosselii TO7 | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 102-2 | |
dc.description.degree | 博士 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 邱文英(Wen-Yen Chiu),胡小婷(Shiau-Ting Hu),陳昭瑩(Chao-Ying Chen),李昆達(Kung-Ta Lee),徐駿森(Chun-Hua Hsu) | |
dc.subject.keyword | 聚羥基烷酸酯,中鏈聚羥基烷酸酯,假單胞菌屬,β氧化作用,(R)-立體特異性烯?輔?A水合?,第二型PHA聚合?,飽和突變, | zh_TW |
dc.subject.keyword | Polyhydroxyalkanoates,medium-chain-length polyhydroxyalkanoates,Pseudomonas mosselii TO7,β-oxidation,(R)-specific enoyl-CoA hydratase,class II PHA polymerase,saturation mutagenesis, | en |
dc.relation.page | 252 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2014-07-25 | |
dc.contributor.author-college | 生物資源暨農學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 農業化學研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 農業化學系 |
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