阿拉伯芥金屬螯合素合成酶之轉殖株性狀分析及金屬結合位之研究

Abstract

植物螯合素 (phytochelatin, PC) 為一可以和金屬結合的短鏈胜肽，在植物面對重金屬逆境中扮演重要角色，由植物螯合素合成酶 (phytochelatin synthase, PCS, EC 2.3.2.15) 以glutathione (GSH) 為基質所合成。PCS平時常駐且少量表現於細胞中，當遭遇重金屬逆境時活化PCS促進PC合成，而其活性的調控包括磷酸化後修飾及重金屬結合。本實驗室針對這兩類PCS活性調控方式的研究已有諸多進展，發現磷酸化後修飾可調控AtPCS1之活性，並證明AtPCS1上的Thr49位點為活化酵素之磷酸化位置。以AtPCS1缺失植株cad1-3建構表現AtPCS1-T49A突變株之轉殖株，發現補償性轉殖株T49A對鎘的耐受性降低而敏感性上升。延續以上研究，本論文將探討轉殖株中Thr49和重金屬耐受性之間的關聯性，及AtPCS-T49A突變株之蛋白質生理活性。首先，比較植株中AtPCS1磷酸化後修飾差異，並將補償性轉殖株T49A培養於含25 mM CdCl2之培養基，觀察到Thr49突變造成non-protein thiol (NTP)、PC在植株中累積量及AtPCS1活性降低，推測這可能是導致補償性轉殖株T49A於重金屬環境下生長受阻的原因。另一方面，先前的研究確認AtPCS1具有7個金屬結合區，在蛋白質序列上富含Cys。其中Cys342-Cys343及 Cys385-Cys359為蛋白質C terminal domain上兩個參與酵素活化的金屬結合位。本論文接續此項成果，繼續探討AtPCS1上其他幾個保守性胺基酸及Cys pair是否為金屬結合位。由序列比對結果選出Cys90-Cys91、Cys109-Cys113、Cys138-Cys144及Glu332，並將這些位點突變為Ser及Ala，發現C90S、C91S、C90-C91S及C109-C113S及C138-144S突變株對鎘結合能力和酵素催化活性都大幅下降，尤其是C90-C91S及C109-C113S突變後AtPCS1喪失生成PC之能力，因此推測這兩對Cys pair可能在維持AtPCS1完整活性上扮演重要的角色。