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http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/46625
標題: | 人類細胞萃取液對亞黃嘌呤之修復機制分析 Mechanistic Study of Deoxyinosine Excision Repair by Human Cell Extracts |
作者: | Shi Chen 陳曦 |
指導教授: | 方偉宏 |
關鍵字: | 亞黃嘌呤,人類細胞萃取液, Deoxyinosine,Human Cell Extracts,Hypoxanthine,alternative excision repair, |
出版年 : | 2010 |
學位: | 碩士 |
摘要: | 生物體細胞中的DNA進行自發性的反應或是受到外源性的攻擊,導致特定的核酸損傷,例如腺嘌呤(Adenine; A)產生自發性的水解或是遭受致烷基劑的傷害即會進行脫胺作用而轉變為亞黃嘌呤 (Hypoxanthine;Hx),而以亞黃嘌呤為含氮鹼基在DNA當中構成的base稱為deoxyinosine (dI)。因dI在DNA進行複製時傾向與dC配對,一旦產生這樣的核酸損傷而未被完整的修復,極可能衍生為A:T→G:C的transitoin mutation。
已知人類細胞中的alkyladenine DNA glycosylase (AAG)可將dI移除進行BER (base excision repair)的修復。然而在大腸桿菌中除了BER系統之外,另會藉由nfi基因的產物endonuclease V所主導的 alternative excision repair (AER)途徑修復DNA中的dI。先前文獻在哺乳類動物小鼠以及人類細胞中皆已發現endo V的homolog,且由試管中實驗證實小鼠細胞的endonuclease V會於dI 3’端第二個磷酸鍵進行切除而形成3’端氫氧基與5’端磷酸基,此部分與已知的E.coli endo V-mediated AER作用相同。因此本實驗以人類細胞萃取液將dI受質進行試管中修復來探討有哪些核酸修復系統會參與其中。 實驗結果發現,MMR proficient的HeLaS3以及MMR deficient(hMLH1 defective)的HCT116人類細胞萃取液皆可有效的修復dI-G受質。於HeLaS3細胞萃取液中加入DNA pol α, δ, ε的抑制劑aphidicolin(APH)進行反應,會降低大約50% dI-G受質的修復效率;然而於HCT116細胞萃取液中加入APH對受質修復的效率卻無顯著影響,因此推測MMR系統中的hMLH1會參與部分dI-G受質的修復。 dI-G受質於HeLaS3及HCT116人類細胞萃取液之反應需求進行分析皆發現,若不加入鎂離子修復反應無法進行;缺乏dNTPs修復效率會降低;缺乏ATP或加入ATP-γ-S則會大幅降低修復效率,推測將dI-G受質進行辨識及修復的蛋白是需要與ATP結合並且水解ATP。針對ATP做反應需求之濃度測試,發現ATP濃度太低或太高受質修復效率皆不佳,因此可知ATP對受質的修復扮演了決定性的角色。 Polβ除了參與在BER之中,推測也會涉及人類endonuclease V對dI受質的修復,我們以Polβ抑制劑lithocholic acid(LCA)發現其會抑制HeLaS3以及HCT116細胞萃取液對dI-G受質的修復效率,因此可知polβ對受質的修復具有一定的重要性。 另外,我們也以dI-T受質於相同條件下進行反應並與dI-G之修復效率相互比較後發現,dI-T於HeLaS3細胞萃取液中的修復效率較低;在HCT116細胞萃取液中則幾乎不被修復。這個結果暗示了在人類細胞中可能有不同的活性可以處理dI損傷,而不同的核酸修復系統對於dI-G與dI-T的作用活性也不相同。 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/46625 |
全文授權: | 有償授權 |
顯示於系所單位: | 醫學檢驗暨生物技術學系 |
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