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標題: | 幽門螺旋桿菌imp/ostA與msbA基因功能與抵抗疏水性抗生素機制探討 Characterization of imp/ostA and msbA functions and the mechanism in hydrophobic drugs resistance of Helicobacter pylori |
作者: | Hung-Chuan Chiu 邱泓銓 |
指導教授: | 王錦堂(Jin-Town Wang) |
關鍵字: | 幽門螺旋桿菌,戊二醛,N-phenylnapthylamine,imp/ostA,msbA, Helicobacter pylori,gluteraldehyde,N-phenylnapthylamine,imp/ostA,msbA, |
出版年 : | 2009 |
學位: | 博士 |
摘要: | 在醫院中,細菌藉由消毒不完全的內視鏡而傳播到下一位使用者的是常見的情況。一般而言,內視鏡的使用後的處理包括事先的清潔 (manual pre-cleaning) 與利用戊二醛 (glutaraldehyde) 作浸泡消毒,但是這個過程仍舊無法將細菌完全的殺死,有些對於清潔劑或是有機溶劑耐受性的細菌會經由未知的機制在此過程中存活。有鑑於此,我們的利用0.1 %戊二醛的培養基去篩選結果包含有幽門螺旋桿菌NTUH-C1 DNA片段的表現基因庫的結果,我們總共找到七個菌落,經由序列比對的結果顯示,其中五顆菌落的基因比對為涵蓋HP0929-HP0930的區域,另外兩顆菌落的基因序列比對為imp/ostA這個基因,此基因片段經表現蛋白並製備多株抗體,使用OstA多株抗體去偵測正常株以及突變株的細胞萃取物可以發現imp/ostA在幽門螺旋桿菌中不為一個必要的基因,有機溶劑測試的結果顯示imp/ostA在有機溶劑抵抗性上所扮演的角色,抗生素測試的結果顯示imp/ostA的突變株對於β-lactam 以及疏水性的抗生素具有敏感性,N-phenylnapthylamine (NPN) assay的結果顯示,imp/ostA突變株的外膜通透能力與正常株比較起來約增加了50% (P< 0.001) 。
我們想更近一步了解戊二醛耐受性的作用機制,從1991-2000年台大醫院內視鏡鏡檢所分離出來的49株臨床菌株中,我們測試其對於戊二醛的最小抑菌濃度以及與imp/ostA基因表現的相互關係。在RNA層次上,imp/ostA的基因表現量,在戊二醛最小抑菌濃度4~10μg/ml的菌株明顯高於戊二醛最小中抑菌濃度1~3 μg/ml的菌株,此外,我們挑選了一株戊二醛耐受性較高的菌株NTUH-S1,並且以戊二醛誘導其基因表現,經由基因微陣列的結果,我們發現有40個基因表現量上升,而有31個基因表現量下降,在表現量上升的基因之中,除了之前所鑑定的imp/ostA這個基因外,我們還發現在在功能上與imp/ostA同為假設性脂多醣生合成有關的基因的msbA進行研究,研究結果顯示,imp/ostA以及msbA的突變株,對於戊二醛或是疏水性抗生素的敏感性與正常株比較起來,都有增加的趨勢,而imp/ostA與msbA雙重突變株對於戊二醛以及疏水性抗生素產生高度敏感性。銀染的結果則顯示了,脂多醣的含量在imp/ostA以及msbA突變株中都有減少的情形,而在imp/ostA與msbA雙重突變株中則大為減少。外膜通透性的實驗說明了,imp/ostA與msbA兩個基因的雙重突變會造成外膜對於毒物通透性大為增加。Ethidium bromide累積測試的實驗顯示了,MsbA在功能上面,牽涉到將疏水性藥物從菌體內排出到菌體外的功能。 總而言之,在這些臨床菌株中,經由戊二醛的刺激,imp/ostA與msbA基因的表現與戊二醛的耐受性之間是有關聯性的,Imp/OstA與MsbA在疏水性藥物的耐受性與脂多醣的生合成上具有協同作用並且扮演重要的角色。 Pre-cleaning and soaking in glutaraldehyde is the necessary procedure to disinfect endoscopes. However, some chemical solvent tolerance bacteria may survive after incomplete endoscopic disinfection. Basing on this, we selected the expression library of H. pylori strain NTUH-C1 with 0.1 % glutaraldehyde obtained seven colonies. After DNA sequencing, DNA fragments of five colonies were identical (homologous to 2.2 kb DNA fragment containing HP0929 and HP0930 of H. pylori strain 26695) and DNA fragments of the other two of the seven colonies were identical (homologous to HP1216 of H. pylori strain 26695). OstA recombinant protein was expressed and used to generate anti-OstA polyclonal antibody. Using OstA polyclonal antibody against cell lysate of wild-type and imp/ostA mutant showed that it is not essential in H. pylori. Organic solvent tolerance assay demonstrated the role of imp/ostA in organic solvent tolerance. Antibiotic susceptibility test showed that the mutation of imp/ostA was susceptible to hydrophobic and β-lactam antibiotics. NPN assay demonstrated that the level of outer membrane permeability was increased 50 % in mutant strain comparing to wild-type strain (P< 0.001). We sought to further clarify the mechanism of glutaraldehyde resistance. The minimal inhibitory concentrations of glutaraldehyde and imp/ostA RNA expression in 49 clinical isolates from National Taiwan University Hospital were determined. After glutaraldehyde induction, RNA expression was higher for strains with minimal inhibitory concentrations of 4~10 μg/ml than for strains with minimal inhibitory concentrations of 1~3 μg/ml. When a microarray was used to study full-genome expression of a strain NTUH-S1 with minimal inhibitory concentration of 6 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/44278 |
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顯示於系所單位: | 微生物學科所 |
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