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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 曲芳華(Fang-Hua Chu) | |
dc.contributor.author | Yan-Liang Lin | en |
dc.contributor.author | 林彥良 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-13T03:45:51Z | - |
dc.date.available | 2006-07-31 | |
dc.date.copyright | 2006-07-31 | |
dc.date.issued | 2006 | |
dc.date.submitted | 2006-07-26 | |
dc.identifier.citation | 林巖,郭幸榮,陳振榮 (1999) 外源甲基轉移酶核酸之表現對甜楓苗木生長及生理性狀之影響。臺灣林業科學 14(1): 77-86
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Marita, J. Ralph, C. Chen, B. Burggraeve, M. V. Montagu, E. Messens and W. Boerjan (2000) Modifcations in lignin and accumulation of phenolic glucosides in poplar xylem upon down-regulation of caffeoyl-coenzyme A O-methyltransferase, an enzyme involved in lignin biosynthesis. The Journal of Biological Chemistry 275: 36899–36909 Moyle, R., J. Moody, L. Phillips, C. Walter, and A. Wagner (2002) Isolation and characterization of a Pinus radiata lignin biosynthesis-related O-methyltransferase promoter. Plant Cell Reporter 20: 1052-1060 Önnerud, H. (2003) Lignin Structures in Normal and Compression Wood. Evaluation by Thioacidolysis Using Ethanethiol and Methanethiol. Holzforschung 57: 377–384 Pakusch, A. E., R. E. Kneusel and U. Matern (1989) S-adenosyl-L-methionine: trans-caffeoyl-coenzyme A 3-O-methyltransferase from elicitor-treated parsley cell suspension cultures. Archives of biochemistry and biophysics 27: 488-494 Peter, G., and D. 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dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/32378 | - |
dc.description.abstract | 木質素為植物體內含量僅次於纖維素之重要成分,於木質素生合成過程中,甲基轉移酵素扮演相當重要的角色。本研究依據基因資料庫中數個已發表之草本和木本植物Caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase (CCoAOMT)基因序列,在具有高保守性的序列中設計引子對,並於紅檜試材中,選殖出526個鹼基對大小之片段,再經由5’和3’ RACE (Rapid Amplify of cDNA End)及Genome walking後共計獲得1724個鹼基對,所得之基因則命名為CfCCoAOMT,其中蛋白質轉譯區有750個鹼基對,可產生249個胺基酸。根據親緣關係圖顯示,CfCCoAOMT與台灣杉的CCoAOMT基因的親緣關係最為相近,並與火炬松和挪威雲杉之針葉樹同屬一分支。本研究並針對紅檜進行南方雜合分析顯示CfCCoAOMT在紅檜的基因體核酸中應該具有2個拷貝數,而在北方雜合分析結果發現,CfCCoAOMT以發育中木質部的表現量最高。而由紅檜之CfCCoAOMT基因轉入大腸桿菌中大量表現的重組蛋白,則製作成多株抗體進行免疫雜合反應,當紅檜受物理彎曲之處理時,藉由Tissue printing觀察到CfCCoAOMT基因在受壓面具有較高的表現量。由於木本植物與草本植物具有不盡相同的木質素生合成機制,在轉基因的試驗當中發現木質素生成的總量在正義股CfCCoAOMT的轉殖株中並無太大改變,而反義股的轉殖株中有些微升高的趨勢;然而無論正義股或反義股的煙草轉殖株在G lignin/S lignin的比值上皆有明顯增加的趨勢。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Lignin is the second abundant biopolymer and less then cellulose present in the cell wall of plant. The previous reports have shown that O-methyltransferase (OMT) plays as a key enzyme for stepwise biosynthesis of lignin. Our current study focused on the Caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase, abbreviated as CCoAOMT, in Chamaecyparis formosensis. By using polymerase chain reaction with designed degenerated primers from highly conserved region of many herbaceous and woody plants were taken as references, 526 base pairs (bp) of DNA fragment were obtained. Then the 5’ and 3’ RACE (Rapid Amplify of cDNA End) coupled with the Genome walking were used to clone the full length of CCoAOMT. After combining the sequence data, there was a total of 1724 bps in full length. The coding region of this DNA fragment was 750 bps, which can be translated to 249 amino acids. The gene was named as CfCCoAOMT. The result of phylogenetic tree shows that C. formosensis is most similar to the CCoAOMT of Taiwania cryptomerioides and is categorized to the same branch with Pinus taeda and Picea abies. Analyzing C. formosensis with Southern blotting, the results show that there are two copies of CfCCoAOMT in C. formosensis’ genome. Moreover, the developing xylem from C. formosensis has the most abundance expression pattern by using the Northern blotting analysis. The CfCCoAOMT gene was constructed into the E. coli to generate a great quantity of CfCCoAOMT recombinant protein and the polyclonal antibody was produced by purifying recombinant protein. Using tissue printing to observe the expression pattern in C. formosensis stem with mechanical bending and found there is a greater expression in the compression site. Because the lignin biosynthesis pathway in woody plant and herbaceous plant are quite different, the CfCCoAOMT’s coding region of C. formosensis was taken to transform into tobacco, a type of herbaceous plant, using Agrobacterium mediated transgenic method. Klason’s lignin method was then used to monitor the total lignin content in transgenic tobacco. The resulting tobacco did not present much difference in sense transgenic line but the content in antisense transgenic line had slightly increased. The pyrolysis GC-MS monitored each G and S lignin in transgenic line and found that the G/S ratio increased dramatically in all the transgenic line. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-13T03:45:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-95-R93625022-1.pdf: 2116683 bytes, checksum: dfbd0eee9b7c62ae0f95f8eec18074ef (MD5) Previous issue date: 2006 | en |
dc.description.tableofcontents | 一、緒言•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
二、前人研究•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2 2.1 植物生長之特性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2 2.2 木質素在植物生長所扮演之角色•••••••••••••••••••••••••••••••••••3 2.3 甲基轉移酵素於木質素生合成之角色•••••••••••••••••••••••••••••••5 2.4 利用農桿菌進行基因轉殖之特性•••••••••••••••••••••••••••••••••••7 三、材料與方法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8 3.1 植物材料•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8 3.1.1紅檜Chamaecyparis formosensis••••••••••••••••••••••••••8 3.1.2 其他樹種材料•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8 3.1.3 提供基因轉殖實驗之煙草•••••••••••••••••••••••••••••••••••8 3.2 載體(vector) ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8 3.3 實驗所使用之菌株••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••10 3.4 實驗藥品•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11 3.5 總量RNA之抽取•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11 3.5.1 實驗所需之溶液配製條件如下••••••••••••••••••••••••••••••11 3.5.2 總量RNA抽取之實驗步驟•••••••••••••••••••••••••••••••••12 3.5.3 甲醛變性洋菜膠體電泳••••••••••••••••••••••••••••••••••••12 3.6 反轉錄反應與合成雙股cDNA•••••••••••••••••••••••••••••••••••••13 3.6.1 反轉錄反應之步驟••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••13 3.6.2 合成雙股之DNA之步驟••••••••••••••••••••••••••••••••••••14 3.7 紅檜CCoAOMT專一性序列片段之選殖••••••••••••••••••••••••••••14 3.7.1 專一性序列之引子設計••••••••••••••••••••••••••••••••••••14 3.7.2 專一性序列之PCR增殖••••••••••••••••••••••••••••••••••••14 3.8 洋菜膠電泳與PCR產物之純化••••••••••••••••••••••••••••••••••••15 3.9 質體建構(Plasmid construction) •••••••••••••••••••••••••••••••16 3.9.1 T-A cloning••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16 3.9.2 大腸桿菌勝任細胞之轉型作用(Transformation) •••••••••••••16 3.9.3 大腸桿菌之快速篩選••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17 3.9.4 大腸桿菌之培養與質體之抽取(Plasmid minipreparation)•••••17 3.9.5 基因定序••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••18 3.10 CCoAOMT基因之5’端與3’端序列之釣取•••••••••••••••••••••••••18 3.10.1 合成RACE ready單股cDNA••••••••••••••••••••••••••••18 3.10.2 利用已知DNA片段設計引子進行RACE PCR••••••••••••••••19 3.11 抽取紅檜之基因體核酸(Genomic DNA extraction) ••••••••••••••20 3.11.1 抽取基因體核酸所需之溶液•••••••••••••••••••••••••••••••20 3.11.2 抽取紅檜基因體核酸之步驟•••••••••••••••••••••••••••••••20 3.12 Genome Walking•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21 3.13 CCoAOMT基因序列之親緣關係比較•••••••••••••••••••••••••••••22 3.14 南方雜合分析(Southern hybridization) ••••••••••••••••••••••••22 3.14.1 實驗所需溶液•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22 3.14.2 DNA探針之製備•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23 3.14.3 利用毛細轉移法進行轉印•••••••••••••••••••••••••••••••••24 3.14.4 南方雜合反應•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25 3.15 北方雜合分析(Northern hybridization) ••••••••••••••••••••••••25 3.15.1 實驗所需溶液•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25 3.15.2 利用毛細轉移法進行轉印•••••••••••••••••••••••••••••••••26 3.15.3 北方雜合反應•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••27 3.16 重組蛋白質表現、純化與多株抗體之製作••••••••••••••••••••••••••28 3.16.1 表現載體之建構•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••28 3.16.2 重組蛋白質之表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••28 3.16.3 重組蛋白之收集與純化•••••••••••••••••••••••••••••••••••29 3.16.4 多株抗體之製作••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••29 3.17 蛋白質電泳與免疫雜合反應(Western hybridization) ••••••••••••29 3.17.1 實驗所需溶液•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••29 3.17.2 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis)•30 3.17.3 免疫雜合反應(Western hybridization) •••••••••••••••••••31 3.17.4 Tissue printing••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••31 3.18 煙草之基因轉殖實驗•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••31 3.18.1 轉殖用載體之建構•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••31 3.18.2 農桿菌勝任細胞之製作與轉型•••••••••••••••••••••••••••••32 3.18.3 農桿菌轉殖法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••33 3.18.4 轉殖煙草之篩選•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34 3.19 木質素之測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34 3.19.1 轉殖煙草之處理•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34 3.19.2 Klason lignin的測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••34 3.19.3 Pyrolysis GC-MS•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35 四、結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••36 4.1 紅檜CCoAOMT基因序列之選殖••••••••••••••••••••••••••••••••••36 4.2 CCoAOMT基因之親緣關係演化樹狀圖••••••••••••••••••••••••••••42 4.3 南方雜合分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••44 4.3.1 DNA探針之製備••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••44 4.3.2 南方式雜合反應••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••44 4.4 北方雜合分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••45 4.4.1 RNA探針之製備••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••45 4.4.2 紅檜不同部位之CCoAOMT表現程度••••••••••••••••••••••••45 4.5 重組蛋白之表現、純化與多株抗體之製作•••••••••••••••••••••••••••46 4.5.1 重組蛋白之誘導表現••••••••••••••••••••••••••••••••••••••46 4.5.2 免疫雜合分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••48 4.5.3 重組蛋白之純化與濃縮••••••••••••••••••••••••••••••••••••48 4.5.4 Anti-CCoAOMT之多株抗體的製作••••••••••••••••••••••••49 4.6 紅檜苗木之Tissue printing•••••••••••••••••••••••••••••••••••••50 4.7 煙草之基因轉殖實驗••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••51 4.7.1 轉殖質體之建構•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••53 4.7.2 農桿菌之轉型作用••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••53 4.7.3 農桿菌感染煙草葉片進行基因轉殖與選殖••••••••••••••••••••53 4.7.4 轉殖煙草之CCoAOMT基因表現量••••••••••••••••••••••••••57 4.7.5 轉殖煙草之木質素生合成狀況••••••••••••••••••••••••••••••57 五、討論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••59 5.1 木質素的重要性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••68 5.2 CCoAOMT基因之選殖及特性•••••••••••••••••••••••••••••••68 5.3 CCoAOMT之重組蛋白表現與純化••••••••••••••••••••••••••••68 5.4 利用轉基因技術研究CCoAOMT之特性•••••••••••••••••••••••71 六、結論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••74 七、引用文獻•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••76 常用溶液配方•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••83 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 紅檜Caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase基因之選殖及其轉基因煙草木質素分析 | zh_TW |
dc.title | Molecular cloning of Caffeoy-CoA 3-O-methyltransferase gene from Chamaecyparis formosensis and lignin analyzing in its transgenic tobacco | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 94-2 | |
dc.description.degree | 碩士 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 林讚標(Tsan-Piao Lin),陳振榮(Zenn-Zong Chen),張上鎮(Shang-Tzen Chang),王升陽(Sheng-Yang Wang) | |
dc.subject.keyword | 紅檜,木質素,甲基轉移酵素,轉基因,煙草, | zh_TW |
dc.subject.keyword | Chamaecyparis formosensis,lignin,Caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase,CCoAOMT,transgenic,tobacco, | en |
dc.relation.page | 86 | |
dc.rights.note | 有償授權 | |
dc.date.accepted | 2006-07-26 | |
dc.contributor.author-college | 生物資源暨農學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 森林環境暨資源學研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 森林環境暨資源學系 |
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