第一部份:以樹突細胞為主的免疫療法在器官移植的應用 第二部份:白藜蘆醇的抗腫瘤效果與機轉

Abstract

第一部分 雖然器官移植的成果已逐年改善，但有一些種類的移植成果如小腸移植等仍不理想。主要的問題包括反覆急性排斥以及必須長期使用廣效免疫抑制劑所引發的嚴重感染。要解決這個問題，發展更具異體專一性的免疫抑制劑來抑制異體免疫反應，營造免疫耐受性，減低抗排斥藥的劑量，是我們努力的方向。樹突細胞在移植的免疫反應中扮演著核心角色。如果能夠調節樹突細胞表現一些免疫調節蛋白，應該可以牽動後續的免疫反應。用藥物來調節樹突細胞表現免疫調節蛋白應是一種可行的方式。 雷公藤素，是一種植物鹼，有免疫抑制的效果，但其在樹突細胞上的影響並不清楚。我們研究雷公藤素在樹突細胞的效果，並研究雷公藤素處理後的樹突細胞對異體免疫反應在體內與體外的影響。用流式細胞儀探究CD80與CD86的表現，發現雷公藤素會減低樹突細胞CD80與CD86的表現，用ELISA研究樹突細胞對IL-10與IL-12的分泌，我們發現IL-10在治療後會明顯的增加(P<0.0001)。我們進一步探究雷公籐素治療後的樹突細胞對異體免疫反應的影響，我們發現其會引起低的混合淋巴球試驗，此抑制作用可以用anti-IL-10所拮抗。最後，我們利用皮膚移植的模式，將雷公藤素處理的樹突細胞在移植一周前先adoptively注射入受贈者體中，發現雷公藤素處理的樹突細胞注入的組別其移植物存活時間比起對照組有明顯的增長(P<0.005)，且移植物的細胞浸潤在與對照組同一時間點時，明顯降低。這個實驗證明雷公藤素治療後的樹突細胞會造成免疫抑制，保護graft延長存活，而這個免疫抑制效果與IL-10有部份相關。 除了利用外在的藥物等改變樹突細胞外，樹突細胞本身的特性或種類也可能引起不同方向的免疫反應。由於肝臟是人體內最容易引起免疫耐受性的器官，肝臟樹突細胞應該扮演重要的角色。然而當中的分子機制並不完全清楚，可能涉及肝臟樹突細胞innate與acquired的免疫調節。我們希望探究LPS每天對肝臟樹突細胞的刺激扮演什麼角色，首先研究肝臟樹突細胞的TLR的mRNA表現，發現它與骨髓樹突細胞都表現高量的TLR4。肝臟樹突細胞的表型表現相對的低的CD80, CD86, 與B7-H1。在TLR4的ligand(LPS)接合之後，骨髓樹突細胞與肝臟樹突細胞都增加NF-kB的核轉位，表示這個TLR4接合後的訊息路徑在兩者是完整的。但是LPS接合會增加骨髓樹突細胞增加表現CD80, CD86與B7-H1，且增加IL-12，TNF-α，並有意義的增加他們的異體刺激活性(allostimulatory activity)，從混合淋巴球試驗(cpm 32000±3577, vs. 23000±1689 in control, p<0.05)與毒性淋巴球試驗(E/T=100/1, 38.6±1.6%, vs. 14.8±2.4% in control, p<0.05)都有意義的增加可以看出。也引起後續T細胞增加IL-2與IFN-γ的分泌。相反的，肝臟樹突細胞在LPS刺激之後只有明顯的增加B7-H1的表現，而這個LPS刺激的樹突細胞合成IL-10，IL-1，和IL-6，而異體刺激活性有些許的增加混合淋巴球試驗(14800±1397 vs. 6200±3441 in control, p<0.05)與毒性淋巴球試驗(E/T=100/1, 18.6±2.6% vs. 5.6±0.4% in control, p<0.05)，而後續引發的T細胞產生IL-10。用CFSE分裂試驗看出T細胞在LPS刺激的肝臟樹突細胞培養之後同骨髓樹突細胞般也是旺盛分裂，代表其抗原表現良好。我們最後用B6的脾細胞先將BALB/c的T細胞激活，再將激活的T細胞用各種樹突細胞再刺激，我們發現用LPS刺激的骨髓樹突細胞可以引起強烈的CTL反應(E/T=40/1, 65.5 ±2.4%)，然而用肝臟樹突細胞的就很弱(E/T=40/1, 14±0.8%)。這個T細胞的低反應性可以用阻斷性B7-H1抗體治療而逆轉，或是用B7-H1 KO小鼠而得到改善(45±4.22% or 45±2.7%, p<0.05 vs. WT LPS-LDCs 14±0.8%)，指出肝臟樹突細胞的免疫耐受活性中TLR4/B7-H1這個路徑扮演重要的角色。 經由這個實驗，我們不但了解了用雷公藤素來調節樹突細胞的免疫特性及其機轉，也進一步探討不同種類的樹突細胞有不同的特性。肝臟樹突細胞具有低成熟度的特性，在TLR4的innate免疫刺激下會選擇性增加B7-H1的表現，而引發異體T細胞的低反應，而這個低反應性可以用B7-H1阻斷而逆轉。整體而言，用樹突細胞為主的免疫療法來調節異體免疫反應是可行的，未來將繼續在這個領域上努力，以造福病人。 第二部分 神經母細胞瘤(neuroblastoma)及神經膠質瘤(glioma)的預後都不好，因此對於這二種惡性腫瘤研發有效的治療方法是必要的。Resveratrol是一天然的多酚(polyphenol)，對於腫瘤有預防及治療的作用，但是它對於神經母細胞瘤及神經膠質瘤的作用並不清楚。在本研究中，首先我們以各種濃度的resveratrol治療Neuro-2a神經母細胞瘤細胞，探討resveratrol對於神經母細胞瘤細胞的增殖分裂、細胞凋亡及細胞週期的影響；並以西方墨點分析(western blot analysis)研究resveratrol對於細胞的cyclin E及p21的表現，結果發現resveratrol對於神經母細胞瘤細胞有細胞毒性，且會增加其細胞凋亡，並造成細胞堆積在細胞週期的S期，降低p21及增加cyclin E的表現。以腹膜腔內注射40 mg/kg/day resveratrol治療小鼠皮下神經母細胞瘤28天，結果發現resveratrol會抑制皮下神經母細胞瘤的生長速度，使小鼠有70%的長期存活率。接著，我們以不同濃度的resveratrol治療大鼠RT-2神經膠質瘤細胞，然後探討resveratrol對於RT-2細胞的細胞毒性及細胞凋亡的影響，發現resveratrol對於神經膠質瘤細胞有細胞毒性，而且會引起細胞凋亡，其作用與resveratrol的濃度及治療時間有關(P<0.05)。再以reverse transcription-PCR分析resveratrol對於RT-2神經膠質瘤細胞的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表現，証明resveratrol會抑制神經膠質瘤細胞的VEGF的表現。以resveratrol治療大鼠皮下或腦部神經膠質瘤，發現resveratrol (40 mg/kg/day)對於皮下神經膠質瘤有顯著的抗腫瘤作用，會減緩腫瘤生長速度，延長動物的存活時間及存活率(P<0.05)；相對的，對於腦內神經膠質瘤，resveratrol需提高至100 mg/kg/day才能延長動物的存活時間(P<0.05)，且對於動物存活率沒有影響。以in vitro proliferation assay証明resveratrol會抑制ECV304人臍帶內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells)的增殖分裂，且其作用與濃度有關。以免疫組織學染色顯示resveratrol治療過的皮下神經膠質瘤的微小血管密度(microvessel densities)比對照組少(P<0.01)。以上的結果顯示resveratrol會引起神經母細胞瘤細胞的細胞毒性及細胞凋亡，它會使細胞堆積在S期。細胞堆積在S期的現象可能與p21表現的降低及cyclin E表現的增加有關。此外，resveratrol 對於小鼠的神經母細胞瘤有抗腫瘤作用。Resveratrol對於神經膠質瘤細胞也會引起明顯的細胞毒性及凋亡，對於皮下及腦內神經膠質瘤有抗腫瘤作用，且會抑制皮下神經膠質瘤的血管生成。所以，整體而言，resveratrol可能可以應用於神經母細胞瘤及神經膠質瘤的治療。