人類造骨細胞中,CREB與p300對於Cyr61基因的調控

Chiao-Yi Tsai; 蔡喬薏

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dc.contributor.advisor	林思洸
dc.contributor.author	Chiao-Yi Tsai	en
dc.contributor.author	蔡喬薏	zh_TW
dc.date.accessioned	2021-06-13T02:01:45Z	-
dc.date.available	2007-07-20
dc.date.copyright	2007-07-20
dc.date.issued	2007
dc.date.submitted	2007-07-09
dc.identifier.citation	01. Oncogene. 1997; 14:1753-7. 02. Annu. Rev. Biochem. 1991; 60：281-319 03. Proc Natl Acad Sci U S A.1989; 86:1178-82. 04. Exp. Cell Res. 1987; 170：103-115 05. Greenburg, Nature〈London〉, 1984; 311：433-8 06. Science, 1984; 226：1080-82 07. Proc Natl Acad Sci U S A.1988; 85:1487-91 08. Nature〈London〉, 1988; 334：535-7 09. Mol.Cell. Biol. 1990, 10:3569-77 10. DNA Cell Biol. 1991; 10：293-300 11. J Cell Biol. 1991; 114：1285-94 12. Mol.Cell. Biol.1992; 12：10-21 13. FEBS Lett. 1993; 327:125-30. 14. Exp Cell Res. 1999; 248：44-57 15. Mol Pathol. 2001; 54：57-79 16. Cell Growth Differ. 1991; 2：351-7 17. Mol.Cell. Biol. 1996; 16:1326-34. 18. Oncogene. 1998; 16：747-54 19. J Cell Biochem. 2007 ; 100:1337-45. 20. Brigstock DR. 2003 ;178:169-75. 21. J.Biol.Chem. 1996; 273：3090-96 22. Proc Natl Acad Sci U S A.1998; 95：6355-60 23. Protein Expr Purif. 2005 ;42:219-25 24. Dev. Biol. 1997; 192：492-508 25. J. Bone Miner. Res. 2001;16：S238 26. J Bone Miner Res. 2000;15(6):1014-23. 27. Endocrinology. 1998 ;139:1761-70 28. Mol Cell Biol. 2006 ;26:2955-64. 29. Am J Physiol Cell Physiol. 2001; 281：C1524-32 30. J Biol Chem. 2004; 31 ;279:55675-81. 31. Eur J Biochem. 2003; 270:3408-21 32. Mol Pathol. 2001; 54:170-5. 33. Mol. Cell. 2003; 11：1101-8 34. Proc Natl Acad Sci U S A.1986; 83：6682-86 54 35. Nature. 1988; 334：494-98 36. Mol. Endocrinol. 1990; 4：931-9 37. EMBO J. 1990; 9：225-32 38. Annu. Rev. Biochem. 1999; 68：821-61 39. Nature. 1987; 328：175-8 40. Nature. 1989; 337：749-52 41. Cell. 1989; 59：675-80 42. Science 1974; 184：868-71 43. Trends Genet. 1990; 6：395-400 44. Nature 2000; 403：41-5 45. J Cell Sci. 2001 ;114:2363-73. 46. Curr. Opin. Genet. Dev. 2001; 11：209-14 47. Trends Cell Biol.1997; 7：230-6 48. Gene Dev. 2000; 14：1553-77 49. Mol Cell Biol. 1996 ;16:694-703 50. Cell 1996; 87：953-9 51. Cell 1996; 93：10626-31 52. Proc Natl Acad Sci U S A.1995; 92：11726-30 53. J Mol Med 1996;74：1-12 54. Science 1992; 258：593-7 55. Proc Natl Acad Sci U S A.1999; 96：11458-63 56. J Immunol 1987; 139：2977-83 57. Mol Cell Biol. 1989; 9:2847-53 58. Growth Factors 1998; 15:135-47 59. Growth Factors 1990; 2:157-65 60. Cell Growth Differ 1997; 8:667-676 61. Proc Natl Acad Sci U S A.1986; 83：9739-43 62. Science 1992; 255：1432-34 63. Science 1992; 255：1430-32 64. J Clin Invest 1995; 96：1319-27 65. J Immunol 2000; 165：2149-55 66. J Immunol 1992; 148：1731-36 67. J Immunol 1991; 147：2175-80 68. J Immunol 1997; 159：5648-53
dc.identifier.uri	http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/30348	-
dc.description.abstract	Cysteine-rich protein 61﹙Cyr61/CCN1﹚能跟細胞外間質中的一些分子結合，並且具有血管新生；腫瘤生成；促進胚胎發育之功能。最近，已有文獻報導Cyr61 可促進造骨細胞的分化及增生。然而，Cyr61 和骨生成的關係可能還需要更多的研究去釐清。因此，本研究欲評估在人類造骨細胞﹙U2OS﹚中，Oncostatin-M ﹙OSM﹚誘導Cyr61 基因表現上的調節。在細胞遷移實驗中，我們發現了Cyr61 可促進U2OS 的移動；以西方點墨法偵測發現，OSM 同時會誘導Cyr61 的表現以及 cAMPresponsive binding protein﹙CREB﹚的磷酸化；以Luciferase reporter assay觀察啟動子活性發現，CREB 可提高Cyr61 啟動子的活性，且在Site-directed mutagenesis 則透露CREB 能跟Cyr61 啟動子上特定的位置結合；從 Electrophoretic mobility shift assay﹙EMSA﹚顯示在OSM 的刺激下，CREB 會與DNA 產生結合。另一方面，p300 也可能參與OSM 誘導Cyr61 的過程。Luciferase assay 中，發現了CREB 跟p300 的shRNA 會抑制Cyr61 啟動子的活性。在免疫共沉澱法(Co-immunoprecipitaiton)顯示p300 跟CREB 複合物的形成；此外，Histone acetyltransferase (HAT) assay 也透露在OSM 的刺激下會增加HAT 活性。因此，我們認為OSM 在人類造骨細胞中會刺激CREB 的磷酸化，促進CREB 跟Cyr61 啟動子結合，同時，召集 p300 一同促進Cyr61 的表現，並造成造骨細胞的移動，所以Cyr61 可能會促進骨生成。	zh_TW
dc.description.abstract	Cysteine-rich protein 61(Cyr61/CCN1) involve in angiogenesis,tumorigenesis, embryogenesis and extracellular matrix production. Cyr61 has been reported to promote osteoblast differentiation recently. However, more information regarding the influences of Cyr61 on osteogenesis is needed. Here, we assessed the transcriptional regulation of oncostatin-M (OSM)-induced Cyr61 gene expression in U2OS, a human osteosarcoma cell line with osteoblastic characters.The effects of Cyr61 on osteoblast migration were also explored. In vitro assay showed stimulation effect of Cyr61 on U2OS migration. Western blot revealed that OSM induced significant Cyr61 synthesis and phsphorylation of cAMP responsive binding protein (CREB). Luciferase assay showed elevated Cyr61 promoter activities following CREB stimulation. Site-directed mutagenesis confirmed that CREB bound directly to specific sites on Cyr61 promoter to trigger gene expression. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) revealed significant CREB/DNA cross-talk after OSM stimulation. Transient transfection analyses demonstrated attenuation of Cyr61 promoter activity by CREB and p300 shRNAs.Co-immunoprecipitaiton confirmed the associations between P300 and CREB.Histone acetyltransferase (HAT) assay also revealed increased HAT activities after OSM treatment. In conclusion, OSM stimulates CREB activation, CREB/DNA cross-talk and recruitment of p300 by CREB in human osteoblasts. OSM also upregulates HAT activity. These effects may induce the transactivation of Cyr61, a novel osteoblast migration factor.	en
dc.description.provenance	Made available in DSpace on 2021-06-13T02:01:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-96-R93422010-1.pdf: 2017168 bytes, checksum: 57d39868e7da81a95a844b44626cdf18 (MD5) Previous issue date: 2007	en
dc.description.tableofcontents	目錄目錄----------------------------------------------------------------I 圖次----------------------------------------------------------------V 中文摘要------------------------------------------------------------1 英文摘要------------------------------------------------------------2 第一章：導論--------------------------------------------------------3 1.1 Cyr61 的簡介-----------------------------------------------------3 1.2 Cyr61 的生物功能-------------------------------------------------4 1.3 Cyr61 基因之調控-------------------------------------------------5 1.4 CREB------------------------------------------------------------ 6 1.5 CREB 的活化----------------------------------------------------- 6 1.6 組織蛋白乙醯轉移酶---------------------------------------------- 7 1.7 p300/CBP 的結構與功能--------------------------------------------7 1.8 Oncostatin-M﹙OSM﹚----------------------------------------------9 第二章：實驗目的----------------------------------------------------10 第三章：材料與方法--------------------------------------------------11 I.實驗材料---------------------------------------------------------11 II.實驗方法--------------------------------------------------------13 3.1 細胞培養-------------------------------------------------------13 3.2 細胞移動分析﹙Migration assay﹚-------------------------------- 13 3.3 西方點墨法 (Western blotting)-----------------------------------14 3.3.1 細胞加藥處理------------------------------------------------- 14 3.3.2 蛋白質的萃取------------------------------------------------- 14 3.3.3 配置膠體跟電泳分析------------------------------------------- 15 3.3.4 蛋白質的轉漬 (Transfer)-------------------------------------- 15 3.3.5 抗體的使用--------------------------------------------------- 15 3.4 Luciferase assay------------------------------------------------16 3.4.1 質體轉移 (Plasmid transfection)-------------------------------16 3.4.2 Dual-Luciferase Reporter assay--------------------------------16 3.4.3 Site-directed mutagenesis-------------------------------------17 3.5 膠電泳位移分析 Electrophoresis Mobility Shift Assay(EMSA)-------17 3.5.1 細胞加藥處理------------------------------------------------- 17 3.5.2 細胞核蛋白質的抽取------------------------------------------- 17 3.5.2.1 NucBusterTM Protein Extraction Kit (Novagen)-----------------18 3.5.2.2.John David Dignam method------------------------------------18 3.5.3 Non-denaturing SDS-PAGE---------------------------------------19 3.6 免疫共沉澱法Co-immunoprecipitation/Western blotting-------------19 3.6.1 細胞處理----------------------------------------------------- 19 3.6.1.1 Plasmid transfection----------------------------------------19 3.6.1.2 蛋白質的萃取----------------------------------------------- 19 3.6.2 IP/Western---------------------------------------------------20 3.7 Histone acetyltransferase activity﹙HAT﹚assay------------------20 3.7.1 細胞加藥處理------------------------------------------------- 20 3.7.2 HAT assay-----------------------------------------------------21 3.8 GST-p300 融合蛋白質的表現---------------------------------------21 3.9 統計分析-------------------------------------------------------21 第四章：實驗結果---------------------------------------------------22 4.1 Cyr61 促進U2OS 的migration-------------------------------------22 4.2 OSM 經由刺激CREB phosphorylation 而促進Cyr61 的表現-------------22 4.2.1 OSM 誘導Cyr61 蛋白質的表現------------------------------------22 4.2.2 OSM 促進CREB phosphorylation----------------------------------22 4.2.3 PKA 抑制劑H89 對於Cyr61 的影響--------------------------------23 4.3 Cyr61 promoter 的活性的調控-------------------------------------23 4.3.1 Cyr61 promoter 的活性測試-------------------------------------23 4.3.2 CREB 活化Cyr61 的promoter-------------------------------------23 4.3.3 CREB 可能和Cyr61 promoter 的結合-----------------------------23 4.4 OSM 誘導CREB/DNA 的結合-----------------------------------------24 4.4.1 OSM 促進CREB/DNA 結合------------------------------------------24 4.4.2 Mutant CREB probe 的結果---------------------------------------24 4.5 p300 參與Cyr61 基因的調控----------------------------------------25 4.5.1 p300 活化Cyr61 的promoter-------------------------------------25 4.5.2 p300 和CREB 的結合--------------------------------------------25 4.6 OSM 促進HAT activity--------------------------------------------25 4.7 GST-p300 induction----------------------------------------------26 第五章：實驗討論----------------------------------------------------27 5.1 Cyr61 促進人類造骨細胞的移動------------------------------------27 5.2 OSM 經由刺激CREB phosphorylation 而促進Cyr61 的表現-------------27 5.2.1 OSM 誘導Cyr61 蛋白質的表現------------------------------------27 5.2.2 OSM 促進CREB phosphorylation----------------------------------28 5.3 CREB 活化Cyr61 promoter activity--------------------------------28 5.4 OSM 對於CREB/DNA 結合的影響-------------------------------------29 5.5 p300 的參與-----------------------------------------------------30 第六章：結論--------------------------------------------------------32 第七章：未來研究方向------------------------------------------------33 參考文獻-----------------------------------------------------------53 圖次圖一、Human Cyr61 promoter P1-P6------------------------------------34 圖二、U2OS migration assay 的分析-----------------------------------36 圖三、OSM 誘導Cyr61 生成跟時間有明顯相關----------------------------37 圖四、OSM 誘導CREB 以及CREB 的磷酸化跟時間有明顯相關----------------37 圖五、H89 對OSM 誘導Cyr61 表現的影響--------------------------------38 圖六、Cyr61 promoter activity 的分析--------------------------------39 圖七、分析CREB、P300 對於Cyr61 promoter activity 的影響-------------40 圖八、Site-directed mutagenesis 的分析------------------------------41 圖九、不同作用時間下，OSM 誘導CREB 與DNA 的結合---------------------42 圖十、Mutant probe 對於CREB 跟DNA 結合能力的影響--------------------43 圖十一、P300/CREB complex 的形成------------------------------------44 圖十二、HAT assay---------------------------------------------------45 圖十三、GST-p300 induction------------------------------------------46 圖十四、本研究推論的訊息傳導路徑----------------------------------- 47 附錄一-------------------------------------------------------------48 附錄二-------------------------------------------------------------49 附錄三-------------------------------------------------------------50 附錄四-------------------------------------------------------------51 附錄五-------------------------------------------------------------52
dc.language.iso	zh-TW
dc.title	人類造骨細胞中,CREB與p300對於Cyr61基因的調控	zh_TW
dc.title	CREB and p300 regulate Cyr61 gene expression in human osteoblastic cells	en
dc.type	Thesis
dc.date.schoolyear	95-2
dc.description.degree	碩士
dc.contributor.oralexamcommittee	郭彥彬,蔡芷季
dc.subject.keyword	Cyr61,人類造骨細胞,	zh_TW
dc.subject.keyword	Cyr61,human osteoblastic cell,	en
dc.relation.page	54
dc.rights.note	有償授權
dc.date.accepted	2007-07-09
dc.contributor.author-college	醫學院	zh_TW
dc.contributor.author-dept	臨床牙醫學研究所	zh_TW
顯示於系所單位：	臨床牙醫學研究所

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