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標題: | 臺灣釀酒酵母菌臨床分離菌株之FLO11基因對其mat表現型及其他相關性狀探討
以釀酒酵母菌為模式生物建立研究人類ABCB4蛋白質功能分析之系統 Investigating the Roles of FLO11 on Mat Formation and Other Related Phenotypes in Taiwan Clinical Isolates of Saccharomyces cerevisiae Functional Analysis of Human ABCB4 Protein in Saccharomyces cerevisiae |
作者: | Hsiao-Yun Kuo 郭筱筠 |
指導教授: | 張雅雯 |
關鍵字: | 生物膜,FLO11,釀酒酵母菌,九十六孔微量培養盤黏附性,菌株細胞表面疏,進行性家族性肝內膽汁滯留症,ABCB4 基因突變,釀酒酵母菌,ABCB4 蛋白, mat,FLO11,Saccharomyces cerevisiae,plastic adherence,cell surfacehydrophobicity,antifungal susceptibility,pseudohyphal growth,Progressive familial intrahepatic cholestasis,ABCB4 mutation,Saccharomyces cerevisiae,functional assay, |
出版年 : | 2011 |
學位: | 碩士 |
摘要: | 中文摘要 — 第一部分
在微生物感染中生物膜之形成與微生物之致病力及抗藥性息息相關,菌體是否能黏附於物體表面則為生物膜形成之關鍵因素,釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)為伺機性病原,擁有形成生物膜初始型態結構之能力,特稱為mat型態,Flo11p為形成mat之關鍵蛋白,若有Flo11基因缺失,將無法形成mat結構,此外Flo11p亦與S. cerevisiae塑膠表面黏附能力等相關,先前研究指出與Flo11p相關之性狀,會受到Flo11p表現量及FLO11基因串聯重覆序列之長度與排列影響其表現。 本實驗之研究目標為藉由分析台灣S. cerevisiae臨床分離菌株與實驗室菌株,比較其形成mat之能力、FL011基因型及相關型態,以探討臨床菌株之可能致病指標及影響mat生成之原因。分析11株台灣臨床分離菌株之mat表現型,發現其中一株YYC343擁有形成mat之傾向,而塑膠表面黏附能力為菌株形成生物膜之第一步,以11株臨床分離株進行研究結果顯示其中7株其黏附於塑膠表面之能力較實驗室菌株YYC377 (S288c)高,其中包含具形成mat傾向之YYC343;此外一般認為菌體表面疏水性於塑膠表面黏附能力扮演重要角色,而實驗結果顯示11株臨床分離株皆擁有較高之細胞表面疏水性。而分析114株YYC343 segregants之mat表現型,發現其中61株四分孢子無mat表現型、17株有典型mat表現型、36株為非典型mat表現型,因此YYC343 segregants提供了良好材料以進一步分析mat表現型與FL011基因型之關係,因而分別從中挑選6株無mat表現型及6株具典型mat表現型之segregants進行FLO11基因串聯重覆序列PCR,發現6株具典型mat表現型,其FLO11基因串聯重覆序列大小比另6株無mat表現型者短約1 kb,且其中央串聯重覆序列排列組合方式亦不相同,而以12株YYC343 segregants進行研究顯示細胞表面疏水性、塑膠表面黏附能力與mat表現型為正相關,具mat表現型之菌株亦擁有較高之細胞表面疏水性及塑膠表面黏附能力,此外12株YYC343 segregants中具有形成假菌絲生長能力之菌株亦具有mat表現型,顯示影響假菌絲生長之FLO11基因亦會同時影響mat表現型之生成,然而於抗黴菌藥物感受性試驗中顯示,不論具有mat表現型之菌株或已形成mat結構之菌體皆不影響其藥物感受性,因此S. cerevisia菌株之mat表現型與其抗黴菌藥物感受性無關。本實驗結果顯示台灣臨床S. cerevisia菌株多具有塑膠表面黏附能力及高細胞表面疏水性,此外細胞表面疏水性、塑膠表面黏附能力與mat表現型為正相關。 關鍵字:生物膜/FLO11/釀酒酵母菌/九十六孔微量培養盤黏附性/菌株細胞表面疏水性/抗黴菌藥物感受性試驗/假菌絲生長 中文摘要 — 第二部分 進行性家族性肝內膽汁滯留症 (progressive familial intrahepatic cholestasis,簡稱PFIC),為一群由基因缺陷而導致肝細胞膽汁排泄功能異常之遺傳疾病,好發於嬰幼兒時期之罕見疾病,發生原因為基因缺陷使得肝細胞無法正常運送膽汁成分至細胞外,使得膽汁滯留而引起黃疸等相關臨床症狀,亦可能在一、二十歲時引起肝硬化、肝衰竭,而需進行肝移植手術。 進行性家族性肝內膽汁滯留症分為三型,分別由ATP8B1、ABCB11、ABCB4三種不同基因缺陷所引起,其中第三型進行性家族性肝內膽汁滯留症 (PFIC3) 即為ABCB4 (ATP-binding cassette sub-family B member 4)基因缺陷所造成,ABCB4蛋白主要表現在肝細胞小管膜 (canalicular membrane) 上,為一種phosphatidylcholine floppase,負責將phosphatidylcholine從細胞膜雙層膜之內層膜運送至外層膜上, phosphatidylcholine在膽汁中主要功能為降低膽汁酸中的疏水性特性,保護細胞不受膽汁酸之傷害,若膽汁中無phosphatidylcholine存在,將使膽管細胞受到傷害而進一步引起相關病症。 台大醫院小兒科陳慧玲醫師團隊,於五位PFIC3病患身上發現不同之ABCB4基因突變,包含三種基因缺失突變及一個點突變造成停止碼 (stop codon) 提早出現之基因突變,然而這些ABCB4基因突變與PFIC3疾病之關係,仍未經實驗證實。 本研究使用S. cerevisiae之sec6-4突變株做為生物模式,建立系統表現人類ABCB4蛋白,以便未來進行後續功能分析試驗,進一步分析台灣病患其ABCB4基因突變與PFIC3疾病之關係,選用酵母菌之原因為其擁有培養容易、生長快速、便宜、易操作、大量表現蛋白等優點,而sec6-4突變株其有胞吐作用之缺陷,使其於37℃環境下,在細胞質中含有大量分泌囊胞 (secretory vesicles) 累積,以方便獲得大量含有成熟蛋白質之分泌囊胞,以利未來進行後續功能試驗,為使S. cerevisiae表現人類ABCB4蛋白,本實驗將帶有ABCB4基因之pRS416系列質體送入S. cerevisiae,並以西方墨點法及聚丙烯醯胺膠電泳法確認ABCB4蛋白之表現,卻未如預期偵測到ABCB4蛋白之表現,然而以反轉錄聚合酶連鎖反應證實具有ABCB4 mRNA之表現,另一方面本實驗可自S. cerevisiae之sec6-4突變株成功分離出分泌囊胞,總結來說,本研究將帶有ABCB4基因之pRS416系列質體送入S. cerevisiae,且具有mRNA之表現,然而無法偵測到ABCB4蛋白質之表現,若未來能於S. cerevisiae順利表現ABCB4蛋白,則可利用本實驗之方法,純化出分泌囊胞以進行ABCB4蛋白質功能分析。 |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/27918 |
全文授權: | 有償授權 |
顯示於系所單位: | 醫學檢驗暨生物技術學系 |
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