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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 潘子明 | |
dc.contributor.author | Te-Hua Liu | en |
dc.contributor.author | 劉德華 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-08T03:47:20Z | - |
dc.date.copyright | 2019-01-31 | |
dc.date.issued | 2019 | |
dc.date.submitted | 2019-01-28 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/21799 | - |
dc.description.abstract | 牙周病為牙周致病菌引發牙周組織慢性發炎之疾病,牙周致病菌會於牙齒表面形成牙菌斑,且最終導致齒槽骨流失。此外,氧化壓力亦為導致牙周病之關鍵因子,雖然已有許多文獻指出益生菌具有改善牙周發炎之效果,但乳酸菌發酵產物與牙周病相關之研究並不多。故本研究旨在探討乳酸菌發酵產物於體內及體外模式中抗牙周病之效果。首先,檢測副乾酪乳酸桿菌副乾酪亞種 NTU 101 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101, NTU 101) 與胚芽乳酸桿菌 TWK 10 (L. plantarum TWK 10, TWK 10) 發酵脫脂牛奶與豆奶萃取物之抗氧化及抗菌活性以進行初步篩選,結果顯示,NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物 (NTU101FMEE) 除了表現良好之抗氧化活性外,亦具有抗牙周致病菌 Actinomyces actinomycetemcomitans 與 Porphyromonas gingivalis 之能力。利用脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS) 誘發牙周病之動物模式探討 NTU101FMEE 抑制牙周病之效果,實驗結果顯示,NTU101FMEE 可顯著改善因牙周發炎所導致的體重減輕情況 (p < 0.05),此外,LPS 誘發牙周病大鼠經不同劑量之 NTU101FMEE 處理後,可顯著減少 0.99-2.02 log CFU/g 組織之口腔菌數以及 26.41-37.92% 之齒槽骨流失程度 (p < 0.001),同時亦可發現,NTU101FMEE 可藉由降低因 LPS 所誘發之促發炎細胞激素生成及牙周組織中之氧化壓力,並減緩牙周病大鼠牙周組織中基質金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinases-9, MMP-9) 活性,進而達到改善牙周發炎與損傷之情形。NTU101FMEE 於 LPS 所誘導發炎之小鼠巨噬細胞 RAW 264.7 模式中,可顯著降低促發炎細胞激素生成量 (p < 0.05);此外,NTU101FMEE 亦可藉由顯著減少 27.22-55.31% 之抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 活性與 30.99-49.07% 之 TRAP-positive 細胞數目 (p < 0.05),達到抑制核因子 κB 配體受體致活劑 (receptor activator of nuclear factor κB ligand, RANKL) 誘導蝕骨細胞生成之效果,並可減緩骨吸收面積,上述結果證實 NTU101FMEE 於體外模式中具有抗牙周病之潛能。進一步探討 NTU101FMEE 中具有抗牙周病活性之有效成分,經管柱層析可得細分層 (fraction) 1-7 (F1-7),當 F4 濃度為 100 μg/mL 時與 LPS 組相比顯著下降 IL-6 生成量達 50.84% (p < 0.05),經核磁共振儀 (nuclear magnetic resonance, NMR) 及超高效液相層析串聯質譜儀 (ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS) 之結果鑑定其為酪胺酸與乳酸之混合物,且經 1H-NMR 圖譜積分值判定其混合比例約為 3:1 (3T1L)。此外,經 UPLC 定量後可發現 NTU101FMEE 中之酪胺酸與乳酸含量高於未發酵脫脂牛奶乙醇萃取物。進一步利用 RAW 264.7 與人類牙齦纖維細胞 (human gingival fibroblasts-1, HGF-1) 探討 3T1L 抗牙周病之可能機轉。於 RAW 264.7 細胞模式中,3T1L 可減緩因 LPS 所誘發之促發炎細胞激素含量,同時可有效調節 MMP-9 與基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1) 含量,並抑制經 RANKL 誘導蝕骨細胞分化相關因子。而在 HGF-1 細胞模式中,3T1L 可減緩 LPS 引起胞內活性含氧物、介白素 (interleukin, IL)-6 與 IL-8 生成量。亦可藉由調控磷酸化之細胞外信號調節激酶 (extracellular signal-regulated kinases, ERK)、Jun 胺基末端激酶 (Jun N-terminal kinases, JNK) 與 p38 表現量與核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB) 含量,降低 LPS 所誘發之發炎反應與氧化壓力。綜上所述,自 NTU101FMEE 分離純化出之 3T1L 具有良好抗氧化與抗發炎之效果,具開發成抗牙周病保健成分之潛能。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Periodontitis is a chronic inflammatory disease of the supporting tissues of the teeth associated with periodontal pathogens, and they initiated by the plaque biofilm, that leads to loss of periodontal attachment to the root surface and adjacent alveolar bone and which results in tooth loss. There are evidences that oxidative stress is also a key factor contributing to periodontitis. Although, numerous studies have confirmed that probiotics can improve periodontal inflammation, the specific effects of lactic acid bacteria (LAB) fermented products have not been studied. The current study aimed to assess the anti-periodontitis effect of LAB-fermented products on in vivo and in vitro. In preliminary screening, the extracts from Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101 (NTU 101)- and L. plantarum TWK 10 (TWK 10)-fermented skim milk and soy milk were used to evaluate the ability of anti-oxidation and anti-microbial activities. NTU 101-fermented skim milk ethanol extract (NTU101FMEE) displayed a significant effect not only on anti-oxidation activity but also on ability to against Actinomyces actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis. And we further investigated the prevention effect of NTU101FMEE on lipopolysaccharide (LPS)-induced periodontal disease in rats. NTU101FMEE significantly ameliorated weight loss caused by periodontal inflammation (p < 0.05). Moreover, different dosage of NTU101FMEE treatment also reduced the oral microbial levels by 0.99 to 2.02 log CFU/g tissue and decreased the levels of alveolar bone loss by 26.41 to 37.92% (p < 0.001). We also found that NTU101FMEE improved periodontal inflammation by decreasing the levels of pro-inflammatiory cytokines and reducing oxidative stresses induced by LPS. The matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) activity of gingival tissue which increased by LPS was also significantly reduced by NTU101FMEE (p < 0.05) to improve the periodontal inflammation and damage. In addition, the NTU101FMEE significantly decreased pro-inflammatory cytokines release induced by LPS in RAW 264.7 cells (p < 0.05). Furthermore, NTU101FMEE was found to inhibit receptor activator of nuclear factor κΒ ligand (RANKL)-induced osteoclast differentiation by reducing tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity and the number of TRAP-positive multinucleated osteoclasts by 27.22 to 55.13% and 30.99 to 49.07%, respectively (p < 0.05). And NTU101FMEE also reduced the bone resorption area in pit formation assay. Our results demonstrate that ethanol extract prepared from NTU101FM has excellent anti-periodontitis potential in vitro. Therefore, we further investigated the anti-periodontitis effect ingredient(s) in NTU101FMEE. There were 1-7 fractions (F1-F7) which obtain from column chromatography. At a concentration of 100 μg/mL, F4 significantly reduced IL-6 level by 50.48%, compared with LPS group (p < 0.05). The F4 was identified as a mixture of tyrosine and lactic acid using nuclear magnetic resonance (NMR) and ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS). And the ratio of these two mixtures was about 3:1 (3T1L) which determined by peak area of 1H-NMR spectrum. Moreover, the contents of tyrosine and lactic acid in NTU101FMEE were higher than unfermented skim milk ethanol extract according to the result of UPLC quantitative analysis. And we used the RAW 264.7 and human gingival fibroblasts-1 (HGF-1) cells to assess the anti-periosontits effcts and probably mechanism of 3T1L. In the RAW 264.7 cell model, 3T1L ameliorated LPS-induced the contents of pro-inflammatory cytokines. And 3T1L not only regulated the contents of MMP-9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, but also inhibited the RANKL-induced osteoclastogenesis-related factors. In the HGF-1 cell model, 3T1L attenuated reactive oxygen species generation, IL (interleukin)-6 and IL-8 levels. Treatment with 3T1L decreased inflammatory response and oxidative stress which induced by LPS via down-regulating the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases, Jun N-terminal kinases and p38 and nuclear factor-κB level. In conclusion, our findings demonstrate that 3T1L derived from NTU101FMEE showed favorable anti-oxidation and anti-inflammation effects and could be developed as a functional ingredient with anti-periodontitis effect. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-08T03:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-108-D04b22005-1.pdf: 20861484 bytes, checksum: 1bb38186558185e210efd3052de91fb0 (MD5) Previous issue date: 2019 | en |
dc.description.tableofcontents | 謝誌 I
中文摘要 II 英文摘要 IV 縮寫表 VII 第一章 文獻回顧 1 一、牙周病 (periodontitis) 1 (一) 牙周簡介 1 (二) 牙周病簡介 1 1. 牙齦炎 4 2. 輕度牙周病 4 3. 中度牙周病 7 4. 重度牙周病 7 (三) 牙周病之成因 7 (四) 齒槽骨之流失 8 1. 齒槽骨簡介 8 2. 破壞齒槽骨之機制 8 (五) 牙周病之致病菌 9 1. 牙周病致病菌種類 9 2. P. gingivalis 致病因素 9 3. A. actinomycetemcomitans 致病因素 11 (六) 氧化壓力與牙周病 14 (七) 牙周病之評估 17 1. 牙周病指數 (periodontal disease index, PDI) 17 2. 社區牙周病治療需求指數 (community periodontal index of treatment need, CPITN) 20 (八) 牙周病之治療 20 1. 機械治療 (mechanical treatment) 20 2. 藥物治療 (pharmacological treatment) 22 3. 牙周手術 (surgical treatment) 22 (九) 牙周病之預防 23 1. 口腔衛生習慣 (oral hygiene practices) 23 2. 飲食 (diet) 24 3. 氟化物的使用 (use of fluoride) 24 4. 使用抗菌劑 (use of antimicrobial agents) 24 5. 戒菸 (smoking cessation) 25 二、誘發牙周病動物模式 25 (一) 線結紮 (ligature) 誘導模式 25 (二) A. actinomycetemcomitans 菌株感染誘導模式 25 (三) 注射脂多醣 (lipopolysaccharide, LPS) 誘導模式 26 三、乳酸菌 29 (一) 改善腸胃道功能 29 (二) 調節免疫功能 30 (三) 調節血膽固醇 30 (四) 調節血壓 31 (五) 不易形成體脂肪 31 (六) 增強骨質保健 32 (七) 抑制腫瘤 32 (八) 口腔健康與降低齬齒發生率 33 四、益生菌與牙周病 33 第二章 研究目的與實驗架構 37 第三章 材料與方法 40 一、實驗材料 40 (一) 實驗菌株 40 (二) 實驗細胞 40 (三) 實驗動物 40 (四) 實驗藥品 41 (五) 實驗儀器設備 41 (六) 實驗相關耗材 43 二、實驗方法 43 (一) 菌株活化與保存 43 1. NTU 101 與 TWK 10 43 2. P. gingivalis 43 3. A. actinomycetemcomitans 44 (二) 發酵脫脂牛奶製備 44 1. 乳酸菌發酵脫脂牛奶製備 44 2. 乳酸菌發酵脫脂牛奶水萃取物製備 44 3. 乳酸菌發酵脫脂牛奶乙醇萃取物製備 44 (三) 發酵豆奶製備 45 1. 乳酸菌發酵豆奶製備 45 2. 乳酸菌發酵豆奶水萃取物製備 45 3. 乳酸菌發酵豆奶乙醇萃取物製備 45 (四) 抗氧化活性試驗 46 1. 清除 α, α-diphenyl-β-pricrylhydrazyl (DPPH) 自由基能力測定 46 2. 還原力 (reducing power) 測定 46 3. 螯合亞鐵離子 (Fe2+) 能力測定 47 (五) 抗菌活性試驗 47 1. 瓊脂擴散試驗 (agar diffusion assay) 47 2. 最低抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration, MIC) 48 3. 最低殺菌濃度 (minimum bactericidal concentration, MBC) 48 (六) 小鼠巨噬細胞 RAW 264.7 與人類牙齦纖維細胞 HGF-1 之培養操作與特性檢測 48 1. 細胞培養 48 2. 細胞繼代 49 3. 細胞凍存 49 4. 細胞活化 49 5. 細胞存活率分析 50 6. 一氧化氮含量檢測 50 7. 腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 含量檢測 51 8. 介白素-1β (interleukin-1β, IL-1β) 含量檢測 51 9. 介白素-6 (interleukin-6, IL-6) 含量檢測 51 10. 介白素-17 (interleukin-17, IL-17) 含量檢測 52 11. 介白素-8 (interleukin-8, IL-8) 含量檢測 52 12. 基質金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9) 與基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1) 含量檢測 52 13. 胞內 ROS 生成量測定 52 14. 調節發炎反應相關蛋白之活性 53 15. 以 receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) 誘導 RAW 264.7 細胞分化成蝕骨細胞 (osteoclast differentiation) 53 16. 抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 染色 55 17. 抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 活性檢測 55 18. 骨吸收活性測定 55 (七) 注射 LPS 誘導牙周病之動物模式 56 1. 實驗動物來源與飼養 56 2. 注射 LPS 誘導牙周病動物模式之建立與組別配置 56 3. 動物犧牲與樣品採集 58 (1) 血清之採集 58 (2) 臟器之採集 58 4. 牙齦組織中牙周致病菌之菌數 60 5. 齒槽骨流失 (alveolar bone loss, ABL) 之檢測 60 6. 牙齦組織萃取液製備 61 7. 牙齦組織與血清中抗氧化相關酵素檢測 61 (1) 丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 含量檢測 61 (2) 超氧化物歧化酶 (superoxidase dismutase, SOD) 活性檢測 62 (3) 總抗氧化 (total antioxidant) 活性檢測 62 8. 牙齦組織與血清中發炎細胞激素之含量檢測 62 9. 牙齦組織中蛋白質表現量檢測 63 (1) 蛋白質定量 63 (2) 明膠蛋白酵素電泳法 (gelatin zymography) 63 (八) 具抗牙周病活性之有效成分分離、純化及定量 64 (九) 生物統計分析方法 65 第四章 結果與討論 66 一、試驗樣品初步篩選 66 (一) 乳酸菌發酵脫脂牛奶清除 DPPH 自由基之能力 66 (二) 乳酸菌發酵脫脂牛奶螯合亞鐵離子之能力 66 (三) 乳酸菌發酵脫脂牛奶之總還原力 69 (四) 乳酸菌發酵豆奶清除 DPPH 自由基之能力 71 (五) 乳酸菌發酵豆奶螯合亞鐵離子之能力 71 (六) 乳酸菌發酵豆奶之總還原力 71 (七) NTU 101 發酵脫脂牛奶與豆奶乙醇萃取物對牙周致病菌之抑菌效果 76 (八) TWK 10 發酵脫脂牛奶與豆奶乙醇萃取物對牙周致病菌之抑菌效果 78 (九) 不同乳酸菌株發酵脫脂牛奶與豆奶乙醇萃取物對牙周致病菌之最低抑菌濃度及最低殺菌濃度比較 78 二、NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物於脂多醣誘發大鼠牙周病動物模式中抗牙周病之效果 83 (一) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對脂多醣誘發牙周病大鼠體重之變化 83 (二) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對脂多醣誘發牙周病大鼠口腔病原菌數目變化 85 (三) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對脂多醣誘發牙周病大鼠齒槽骨流失程度之影響 85 (四) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對脂多醣誘發牙周病大鼠牙周組織與血清中促發炎細胞激素變化 87 (五) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對脂多醣誘發牙周病大鼠牙周組織與血清中抗氧化活性之影響 90 (六) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對脂多醣誘發牙周病大鼠牙周組織中 MMP-9 活性之影響 95 三、NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物抗牙周病之機轉 99 (一) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對 RAW 264.7 細胞存活率之影響 99 (二) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對 RAW 264.7 細胞一氧化氮生成量之影響 99 (三) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對 RAW 264.7 細胞發炎激素之影響 101 (四) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對經脂多醣誘發發炎 RAW 264.7 細胞一氧化氮生成量之影響 104 (五) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對經脂多醣誘發發炎 RAW 264.7 細胞發炎激素生成量之影響 104 (六) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物對經 RANKL 誘導蝕骨細胞之生成 106 (七) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物抑制骨吸收作用 108 四、具抗牙周病活性有效成分之分離、鑑定與活性評估 113 (一) NTU 101 發酵脫脂牛奶乙醇萃取物中活性成分之分離、純化及活性評估 113 (二) 3T1L 對 RAW 264.7 與 HGF-1 細胞存活率之影響 121 (三) 3T1L 對經脂多醣誘發發炎之 RAW 264.7 發炎激素生成量之影響 123 (四) 3T1L 對經 RANKL 誘導蝕骨細胞生成相關因子之影響 125 (五) 3T1L 抑制骨吸收作用之影響 125 (六) 3T1L 對經脂多醣誘導 RAW 264.7 細胞中基質金屬蛋白酶-9 與基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1 之影響 128 (七) 3T1L 對經脂多醣誘導 HGF-1 細胞中 ROS 生成量、總抗氧化活性與丙二醛生成量之影響 130 (八) 3T1L 對經脂多醣誘導 HGF-1 細胞中介白素-6 與介白素-8 含量之影響 132 (九) 3T1L 對經脂多醣誘導 HGF-1 細胞中 MAPKs 與 NF-κB 信號路徑表現量之影響 132 第五章 結論 138 第六章 參考文獻 142 第七章 附錄 173 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 副乾酪乳酸桿菌副乾酪亞種 NTU 101 發酵產物抗牙周病之研究 | zh_TW |
dc.title | Study on anti-periodontitis effect of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101-fermented products | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 107-1 | |
dc.description.degree | 博士 | |
dc.contributor.coadvisor | 李昆達 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 周正俊,蔡宗佑,呂彥禮,廖啟成,陳明汝 | |
dc.subject.keyword | 抗氧化,抗牙周病,抗發炎,副乾酪乳酸桿菌副乾酪亞種 NTU 101,酪胺酸與乳酸混合物, | zh_TW |
dc.subject.keyword | anti-oxidant,anti-periodontitis,anti-inflammation,Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101,a mixture of tyrosine and lactic acid, | en |
dc.relation.page | 196 | |
dc.identifier.doi | 10.6342/NTU201900228 | |
dc.rights.note | 未授權 | |
dc.date.accepted | 2019-01-29 | |
dc.contributor.author-college | 生命科學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 生化科技學系 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 生化科技學系 |
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