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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 鄭秋萍(Chiu-Ping Cheng) | |
dc.contributor.author | Chun-You Kuo | en |
dc.contributor.author | 郭俊佑 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-06-08T03:06:20Z | - |
dc.date.copyright | 2021-03-03 | |
dc.date.issued | 2021 | |
dc.date.submitted | 2021-02-17 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/20842 | - |
dc.description.abstract | 由Ralstonia solanacearum (Rs) 引起的青枯病 (bacterial wilt, BW) 是許多重要經濟作物的嚴重病害,抗病育種是防治番茄BW的重要手段。目前具穩定抗BW的番茄品種Hawaii 7996(H7996)之多個數量性狀位點 (QTLs) 雖已定位,然而其涉及之分子機制與主導之防禦基因仍未知。本研究室先前未發表之研究指出H7996具有強烈的廣效初級免疫PAMP-triggered immunity (PTI),且抗第一型Rs (phylotype I) 之主控QTL Bwr12也參與其PTI反應。本研究旨在深入探討在不同番茄品系中,Bwr12基因座內兩個LRR蛋白質12g550與12g520所參與之PTI調控分子機制。在BW抗病與感病品種中12g550與12g520之編碼序列 (coding sequence) 並無差異,但在抗病品種H7996中12g550基因啟動子序列除了有些許 single nucleotide polymorphism (SNPs) 外也短少了308 bp,而12g520基因啟動子序列有兩個SNPs,雖然目前的基因啟動子活性分析初步結果尚無一致結果,或許這些啟動子序列差異造成與不同轉錄因子(transcription factors) 結合進而可能調控基因差異表現。此外,不論有或無Rs感染,在抗病與感病品種中這兩個基因被預測的intron皆存在其轉錄產物中,且導致12g550轉譯提早終止而產生僅有93個胺基酸之蛋白質產物。NbACO2a與NbCYP6為利用共免疫沈澱與奈流液相層析串連二次質譜 (Co-IP-LC-MS/MS) 篩選出12g5501-93AA之可能互作蛋白質,而目前基因功能分析結果顯示12g520、12g5501-93AA、NbACO2a及NbCYP6在菸草PTI反應中均為正向調控者。預期本研究將有助於提供番茄抗青枯病與PTI之關鍵訊息。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Bacterial wilt (BW) caused by Ralstonia solanacearum (Rs) is a global destructive disease of many crops. Tomato cultivar Hawaii 7996 (H7996) is a reliable resistance source against BW; however, the mechanisms of H7996 defense remained undetermined. Our previous studies showed that H7996 displays strong pattern-triggered immunity (PTI) responses, and that the major QTL associated with its BW-resistance, Bwr12, is involved in PTI. This study aimed to comparatively investigate the mechanisms underlying tomato PTI mediated by two LRR genes located in Bwr12, 12g520 and 12g550, in different tomato cultivars. The coding sequences of 12g520 and 12g550 in BW-resistant and -susceptible cultivars are identical. However, in H7996, the 12g550 promoter has a 308-bp deletion and 12g520 promoter contains two single-nucleotide-polymorphisms (SNPs). Although preliminary results of promoter activity assays was not consistent with the transcriptional expressions of these two genes, the differences of predicted transcription factors of these sequences might relate to the differential expression patterns. Furthermore, the predicted introns are present in the transcripts of these genes in both BW-resistant and -susceptible cultivars without or with Rs infection, possibly leading to production of a 12g550 protein product of 93 amino acids due to an early termination in translation. NbACO2a and NbCYP6 are candidate interacting proteins of 12g5501-93AA identified by Co-IP-LC-MS/MS in Nicotiana benthamiana. Current data of functional genetic studies revealed positive roles of 12g520, 12g5501-93AA, NbACO2a and NbCYP6 play positive roles in PTI responses. These results are expected to shed light on plant BW-defense and PTI. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-06-08T03:06:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 U0001-1602202122511400.pdf: 9860681 bytes, checksum: d5756e2daa66a7d79fe1a4e7ca4f1451 (MD5) Previous issue date: 2021 | en |
dc.description.tableofcontents | 口試委員會審定書 I 謝誌 II 中文摘要 III Abstract IV 常用縮寫與全名對照表 V 目錄 VIII 圖目錄 XII 附圖目錄 XIV 第一章 前言 1 1. 植物病害防禦機制 1 1.1. 植物抗病反應 1 1.2. 植物抗病訊息傳遞 2 1.3. PTI 訊息傳遞與其下游相關反應 3 2. 植物白胺酸重複 (leucine rich repeat, LRR) 蛋白質特性 4 2.1. LRR 蛋白質結構與功能 5 2.2. LRR 蛋白質在植物免疫反應之功能 5 3. 青枯病 (bacterial wilt, BW) 6 3.1. 阿拉伯芥之青枯病反應 7 3.2. 番茄之青枯病反應 8 3.3. 其他作物之青枯病反應 9 4. 前人研究與研究動機 10 第二章 材料與方法 12 1. 植物材料與栽培條件 12 1.1. 番茄土耕 12 1.2. 圓葉菸草土耕 12 2. 微生物材料與培養條件 12 2.1. 大腸桿菌 (Escherichia coli DH5α) 12 2.2. 農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 與 MOG101) 12 2.3. 青枯病菌 (Ralstonia solanacearum strain Pss4) 13 2.4. 細菌性斑點病菌 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 Type III secretion system mutant strain Pst hrcC-) 13 3. 選殖技術 (Cloning) 13 3.1. 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 13 3.2. DNA 瓊脂糖凝膠電泳 (agarose gel electrophoresis) 14 3.3. DNA 片段純化 (DNA purification) 14 3.4. DNA 限制酶消化水解 (DNA digestion) 14 3.5. DNA片段結合 (DNA ligation) 15 3.6. TOPO®質體構築 (TOPO® cloning) 15 3.7. LR 重組互換反應 (LR recombination) 15 3.8. Gibson Assembly®質體構築 (In-Fusion® cloning) 15 3.9. 大腸桿菌勝任細胞熱休克轉型作用 (heat shock transformation of E. coli) 16 3.10.電穿孔轉型作用之勝任細胞置備 (preparation for competent cells electroporation)16 3.11.電穿孔轉型作用 (electroporation transformation) 16 3.12.大腸桿菌質體萃取 (plasmid purification of E.coli) 17 4. 植物 DNA 萃取 (extraction of plant DNA) 17 5. 植物 RNA 萃取 (extraction of plant RNA) 17 6. 反轉錄聚合酶連鎖反應 (reverse transcription PCR, RT-PCR) 18 7. 即時定量聚合酶連鎖反應 (real time PCR, RT-qPCR) 19 8. 在菸草葉部中短暫表現蛋白基因 19 9. 植物蛋白質表現檢測 20 9.1. 植物總蛋白質萃取 (extraction of plant total proteins) 20 9.2. 植物膜蛋白質萃取 (extraction of plant membrance proteins) 20 9.3. 蛋白質定量 (proteins quantification) 20 9.4. 蛋白質電泳 (SDS-PAGE) 20 9.5. 西方墨點法 (Western blotting) 21 10. 植物葉部 PTI 反應分析 21 10.1.癒傷葡聚醣累積分析 (callose deposition assay) 21 10.2.總 ROS 檢測 (total ROS of detection) 22 10.3.PTI 反應標誌基因轉錄之檢測 22 11. 接種青枯病菌後番茄基因轉錄之檢測 22 12. 在菸草葉片接種青枯病菌後之啟動子活性分析 23 13. 蛋白質在菸草葉片細胞之定位分析 (subcellular localization in tobacco) 23 14. 篩選與驗證植物體內之互作蛋白質 23 14.1.免疫沉澱法 (immunoprecipitation, IP) 23 14.2.高效液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS)分析 24 14.3.雙分子螢光互補 (bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 24 14.4.共免疫沉澱法 (co-immunoprecipitation, Co-IP) 24 15. 序列分析與統計分析 25 第三章 結果 26 1. Bwr12 中 9 個 LRR (leucine rich repeat) 蛋白質之 domain 分析 26 2. 抗病與感病番茄品系中 12g550 之編碼序列 (coding DNA sequence, CDS) 分析 26 3. 抗病與感病番茄品系中 12g550 RNA 之 intron 存在現象分析 26 4. 12g550 蛋白質表現分析 27 5. 抗病與感病番茄品系中 12g550 之啟動子序列分析 27 6. 可能調控 12g550 表現之轉錄因子預測分析 28 7. 12g550 之啟動子活性分析 28 8. 12g5501-93AA 在菸草 PTI 反應中角色 29 9. 搜尋 12g5501-93AA 之可能植物互作蛋白質 29 10. 12g5501-93AA 可能互作之 NbACO2a 蛋白質檢測 30 10.1.NbACO2a 在菸草 PTI 反應中角色 30 10.2.12g5501-93AA 與 NbACO2a 之蛋白質交互檢測 30 11. 12g5501-93AA 可能互作之 NbCYP6 蛋白質檢測 31 11.1.NbCYP6 在菸草 PTI 反應中角色 31 11.2.12g5501-93AA 與 NbCYP6 之蛋白質交互檢測 31 12. 抗病與感病番茄品系中 12g520 RNA 之 intron 存在情形分析 32 13. 抗病與感病番茄品系中 12g520 編碼序列 (CDS) 分析 32 14. 接種青枯病菌後番茄 12g520 之基因轉錄表現 32 15. 抗病與感病番茄品系中 12g520 之啟動子序列分析 32 16. 可能調控 12g520 表現之轉錄因子預測分析 33 17. 12g520 之啟動子活性分析 33 18. 12g520 在菸草 PTI 反應中角色 33 19. 12g520 蛋白質表現分析 34 第四章 討論 35 1. 不同番茄品系 12g550 序列在啟動子片段具差異性 35 2. 12g550 轉錄表現之調控特性 36 3. 12g5501-93AA 在茄科植物 PTI 反應中為正向調控者 37 4. NbACO2a 在茄科植物 PTI 反應中為正向調控者 38 5. NbCYP6 在菸草 PTI 反應中為正向調控者 39 6. 12g520 序列在不同番茄品系具高度相似性 40 7. 12g520 轉錄表現之調控特性 41 8. 12g520 在茄科植物 PTI 反應中為正向調控者 42 9. 搜尋 12g520 之可能互作蛋白質之探討 43 10. 結語 43 第五章 參考資料 44 圖目錄 表一、以液相層析串接二次質譜系統搜尋圓葉菸草中 12g550 之可能交互作用蛋白質……………………59 圖一、位於 Bw12 區段 LRR (leucine rich repeat) 蛋白質之功能片段預測分析.60 圖二、不同番茄品系中 12g550 之 genomic DNA 核苷酸序列分析…………… 61 圖三、12g550 intron 保留現象分析………………………………………………....63 圖四、N 端 tag 影響 12g550 蛋白質轉譯狀況………………………………….. 65 圖五、不同番茄品系中 12g550 之啟動子序列分析…………………………..…. 69 圖六、12g550 之 5’-UTR 序列分析………………………………………………. 70 圖七、12g550 之啟動子活性分析…………………………………………………. 71 圖八、在圓葉菸草中短暫過量表現 12g5501-93AA 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響……… 73 圖九、在圓葉菸草中短暫過量表現 12g5501-93AA 對葉部 PTI 反應標誌基因表現之影響……… 74 圖十、在圓葉菸草中短暫過量表現 12g5501-93AA 對葉部 callose deposition 反應之影響…… 75 圖十一、在圓葉菸草中短暫過量表現 NbACO2a 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響………………………. 77 圖十二、以 BiFC 檢測 12g5501-93AA 與 NbACO2a 之交互作用………………. 78 圖十三、以共免疫沉澱法(Co-IP)檢測 12g5501-93AA 與 NbACO2a之交互作用.. 79 圖十四、在圓葉菸草中短暫過量表現 NbCYP6 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響………… 80 圖十五、以 BiFC 檢測 12g5501-93AA 與 NbCYP6 之交互作用………………... 81 圖十六、以共免疫沉澱法 (Co-IP)檢測 12g5501-93AA 與 NbCYP6 之交互作用.. 82 圖十七、12g520 intron 保留現象分析……………………………………………... 83 圖十八、不同番茄品系中 12g520 胺基酸序列分析……………………………... 84 圖十九、番茄接種青枯病菌後 12g520 之轉錄表現……………………………... 85 圖二十、不同番茄品系中 12g520 之啟動子序列分析…………………………... 86 圖二十一、12g520 之 5’-UTR 序列分析…………………………………………. 87 圖二十二、12g520 之啟動子序列活性分析………………………………………. 88 圖二十三、在圓葉菸草中短暫過量表現 12g520 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響………… 90 圖二十四、在圓葉菸草中短暫過量表現 12g520 對葉部 callose deposition 反應之影響………………92 附圖目錄 附表一、以液相層析串接二次質譜系統搜尋圓葉菸草中 12g5501-93AA 之可能交互作用蛋白質…… 93 附表二、在植物體內偵測 12g550 蛋白質表現……………101 附表三、針對 H7996 中 12g550 啟動子序列所短少之 308 bp 片段進行轉錄因子預測分析……………102 附表四、六種番茄品系 12g550 上游 2231 bp (-1 ~ -2231 nt) 序列預測共有的可能轉錄因子……103 附表五、六種番茄品系 12g550 上游序列 (除短少片段外) 預測特有的可能轉錄因子…………………………105 附表六、六種番茄品系 12g520 上游 717 bp (-1 ~ -717 nt) 序列預測共有的轉錄因子…………106 附表七、五種番茄品系 12g520 上游 717 bp (-1 ~ -717 nt) 序列預測特有的轉錄因子………………107 附表八、在植物體內以西方墨點法偵測 12g520 重組蛋白質之結果…………..108 附表九、本研究所使用之質體與菌株特性………………………………………..109 附表十、培養基與藥品配方………………………………………………………..113 附表十一、抗生素濃度與配方……………………………………………………..119 附表十二、本研究中所使用之引子………………………………………………..121 附圖一、在圓葉菸草中短暫過量表現 12g550 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響……………………124 附圖二、在圓葉菸草中短暫過量表現 NbACO2a 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響………………125 附圖三、以共免疫沉澱法(Co-IP)檢測 12g5501-93AA 與 NbACO2a之交互作用.126 附圖四、在圓葉菸草中短暫過量表現 NbCYP6 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響………………………127 附圖五、在圓葉菸草中短暫過量表現 12g520 對葉部 PTI 相關之總 ROS 量的影響…………………128 附圖六、12g550 與 12g520 基因構造示意圖……………………………………130 附圖七、以 12g550 序列片段進行轉譯預測……………………………………..131 附圖八、以 VOX 在番茄 WVa700中短暫大量表現 12g520 與 12g5501-93AA 後之青枯病測試……………132 附圖九、五種番茄品系接種青枯病後之病害反應………………………………..133 附圖十、12g550 之 cDNA 基因序列分析………………………………………..134 附圖十一、接種青枯病菌後 12g520 與 12g550 之表現………………………..135 附圖十二、接種青枯病菌後 12g520 與 12g550 之表現 ………………………136 附圖十三、在 WVa700 中短暫過量表現 12g520 及 12g5501-93AA 對 PTI 反應H2O2 累積之影響…137 附圖十四、在 WVa700 中短暫過量表現 12g520 及 12g5501-93AA 對 PTI 反應 callose deposition 之影響……………………………………………...138 附圖十五、大量表現 12g520 轉殖菸草之 PTI 反應 H2O2 累積……………...139 附圖十六、大量表現 12g5501-93AA 轉殖菸草之 PTI 反應 H2O2 累積…...........140 附圖十七、大量表現 12g520 轉殖菸草之 PTI 反應 callose deposition……….141 附圖十八、大量表現 12g5501-93AA 轉殖菸草之 PTI 反應 callose deposition.…142 附圖十九、在不同番茄品系中之 12g520 胺基酸序列比較……………………..143 附圖二十、12g520 蛋白質在菸草葉片中之表現位置..…………………………..144 附圖二十一、12g5501-93AA 蛋白質在菸草葉片中之表現位置………………...145 附圖二十二、在圓葉菸草中短暫過量表現 NbACO2a 對葉部 callose deposition 反應之影響…………146 附圖二十三、在圓葉菸草中短暫過量表現 NbACO2a 對葉部 PTI 反應標誌基因表現之影響……………………147 附圖二十四、在圓葉菸草中短暫過量表現 NbCYP6 對葉部 callose deposition 反應之影響……………148 附圖二十五、觀察 H7996 與 H7998 之葉片型態性狀………………………....149 附圖二十六、12g690 之 cDNA 基因序列分析………………………………….151 附圖二十七、番茄品系 H7996 之 12g690 genomic DNA 與 cDNA 之部份片段序列與其胺基酸序列比較…152 附圖二十八、以西方點墨法檢測 12g690 剪切狀況……………………………..153 附圖二十九、pCR® II/GW/TOPO® 與 pCR® 8⁄GW⁄TOPO® 載體(Invitrogen).154 附圖三十、綠色螢光 GFP 重組蛋白所使用之載體……………………………..155 附圖三十一、黃色螢光 YFP 重組蛋白所使用之載體…………………………..156 附圖三十二、菸草葉片表現 N 端 YFP 重組蛋白所使用之載體……………...157 附圖三十三、菸草葉片表現 N 端 GFP 重組蛋白所使用之載體……………...158 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 番茄初級免疫相關基因座Bwr12內兩個LRR蛋白質之研究 | zh_TW |
dc.title | Study on two LRR proteins in the tomato Bwr12 locus involved in innate immunity | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 109-1 | |
dc.description.degree | 碩士 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 王肇芬(Jaw-Fen Wang),鄭貽生(Yi-Sheng Cheng),劉明容(Ming-Jung Liu),楊淑怡(Shu-Yi Yang) | |
dc.subject.keyword | 番茄,青枯病菌,PTI,Bwr12,LRR,ACO,CYP, | zh_TW |
dc.subject.keyword | tomato,Ralstonia solanacearum,PTI,Bwr12,LRR,ACO,CYP, | en |
dc.relation.page | 158 | |
dc.identifier.doi | 10.6342/NTU202100709 | |
dc.rights.note | 未授權 | |
dc.date.accepted | 2021-02-17 | |
dc.contributor.author-college | 生命科學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 植物科學研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 植物科學研究所 |
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