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標題: | 抗利尿激素誘導之水通道蛋白尖端膜運輸需要肌動蛋白及Rab11的參與 Vasopressin-Induced Apical Aquaporin-2 Trafficking Involves Dynamic Changes of F-Actin and Rab11 |
作者: | Cheng-Wei Chen 陳政瑋 |
指導教授: | 余明俊(Ming-Jiun Yu) |
關鍵字: | 抗利尿激素,水通道蛋白,肌動蛋白動態變化,活細胞影像,Rab11, vasopressin,aquaporin-2,F-actin dynamics,live-cell imaging,Rab11, |
出版年 : | 2012 |
學位: | 碩士 |
摘要: | 抗利尿激素(Vasopressin)藉由增加位於腎臟集尿管上皮細胞尖端膜(apical membrane)的水通道蛋白(aquaporin-2) 的含量,來提高集尿管細胞的水分再吸收,幫助水分回收到身體內。在抗利尿激素的刺激下,水通道蛋白會從集尿管上皮細胞內的囊泡(vesicle)運往尖端膜,藉此增加膜上的水通道蛋白的含量。細胞的尖端膜附近通常有由肌動蛋白微絲(F-actin)組成的細胞骨架以維護細胞型態,這些肌動蛋白微絲將會成為水通道蛋白往尖端膜運輸的阻礙。許多研究顯示,水通道蛋白的尖端膜運輸需要伴隨著肌動蛋白微絲的解離。上述觀察都是利用固定影像(static image)來達成,不易顯現肌動蛋白的動態變化(dynamics)。因此,我們建立一套活細胞影像術,在極化的腎臟集尿管細胞(polarized mpkCCD)中,觀察抗利尿激素所引發的肌動蛋白動態變化。當細胞被抗利尿激素的類似物dDAVP刺激後,位於尖端膜中間的肌動蛋白會有消失的情形,而細胞周圍(apical-lateral membrane)的肌動蛋白則有增加的現象。當以BAPTA-AM螯合細胞內的鈣離子後,抗利尿激素所誘導的肌動蛋白動態變化會被抑制。利用latrunculin B抑制肌動蛋白微絲的聚合,肌動蛋白動態變化會被抑制,同時抗利尿激素所誘導的水通道蛋白的尖端膜運輸也無法發生。以上結果顯示,抗利尿激素可藉由胞內鈣離子引發肌動蛋白微絲的動態變化,達成水通道蛋白的尖端膜運輸。Rab11是一種調控囊泡運輸的蛋白,它會徴招Rab11-FIP2及肌凝蛋白(Myosin),藉此在肌動蛋白微絲上運輸含水通道蛋白的囊泡。共軛焦染色結果顯示,Rab11和水通道蛋白及肌動蛋白有共存現象(co-localization),而且在細胞內表現功能性缺陷的GFP-Rab11時,抗利尿激素所誘導的水通道蛋白尖端膜運輸會受阻礙。我們的結果顯示,抗利尿激素所誘導的水通道蛋白尖端膜運輸需要完整的肌動蛋白微絲和Rab11的參與。 Vasopressin induces renal water reabsorption by increasing the abundance of water channel aquaporin-2 (AQP2) in the apical membrane of collecting duct principal cells. In response to vasopressin, AQP2 redistributes from intracellular vesicles to the apical membrane of the principal cells, increasing the abundance of apical AQP2. For cell shape maintenance, the apical membrane is often decorated with filamentous actin (F-actin), which presents a physical barrier for apical AQP2 trafficking. Numerous studies based on static images suggest that F-actin de-polymerization plays a role in vasopressin-induced AQP2 trafficking. To visualize dynamic changes of F-actin in real time, we devised a live-cell imaging method to observe vasopressin-induced F-actin dynamics in polarized mpkCCD cells. When the cells were stimulated with vasopressin analog dDAVP, F-actin disappeared from the central region of the apical plasma membrane while gradually increasing at the apical-lateral membrane. Intracellular calcium chelator BAPTA-AM blocked the vasopressin-induced F-actin dynamics. F-actin de-polymerization induced with latrunculin B blocked F-actin dynamics and vasopressin-induced apical AQP2 trafficking. These results suggest that vasopressin induces calcium-dependent F-actin dynamics required for AQP2 apical trafficking. Rab11, a regulator of vesicular recycling, is thought to recruit Rab11-FIP2 and myosin Vb for vesicular trafficking along the actin skeleton. Using immunofluorescence confocal microscopy, we found Rab11co-localized with AQP2 and F-actin in the mpkCCD cells. Overexpression of dominant-negative GFP-Rab11 blocked dDAVP-induced apical AQP2 trafficking in the mpkCCD cells. Overall, our results suggest that vasopressin-induced apical AQP2 trafficking requires dynamics of F-actin and Rab11 protein. |
URI: | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/15982 |
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顯示於系所單位: | 生物化學暨分子生物學科研究所 |
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