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DC 欄位 | 值 | 語言 |
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dc.contributor.advisor | 鄭秋萍 | |
dc.contributor.author | Chi-Ying Hsieh | en |
dc.contributor.author | 謝季穎 | zh_TW |
dc.date.accessioned | 2021-05-20T21:11:47Z | - |
dc.date.available | 2016-02-20 | |
dc.date.available | 2021-05-20T21:11:47Z | - |
dc.date.copyright | 2011-02-20 | |
dc.date.issued | 2011 | |
dc.date.submitted | 2011-02-15 | |
dc.identifier.uri | http://tdr.lib.ntu.edu.tw/jspui/handle/123456789/10225 | - |
dc.description.abstract | 由 Ralstonia solanacearum 引起的青枯病為土壤傳播性萎凋病害,在全球造成眾多重要作物的嚴重損失,但目前其致病機制相關資訊仍十分有限,本研究針對青枯病菌 tol-pal 基因群與 RSc0727 在環境適應性與致病力之功能進行研究。本研究室先前已發現含有跳躍子之 tol-pal 突變株在茄科植物的致病力與野生型菌株雷同,但對阿拉伯芥卻幾乎無病原力,且其泳動力下降、細胞結構受損、碳源氧化能力改變。本研究進一步發現 tol-pal 突變株之第三型分泌蛋白系統與在番茄以外的茄科植物上之病原性正常,但藉由逆境及互補實驗證實青枯病菌 tol-pal 基因群為維持細胞完整性與抗逆境之之必需基因;綜合所有結果證實以上種種缺失造成 tol-pal 突變株在非寄主植物阿拉伯芥中之適應能力大減,以致於無法成功造成病害。此外,本研究發現 tol-pal 基因群可分為五個轉錄單位,並隨細菌生長時期調整其基因表現,且可受青枯病菌毒力調控中樞 PhcA 與逆境個別調控,顯示 tol-pal 基因群可藉由精細的分工調控以達成青枯病菌在不同環境與宿主之最佳適應性。另經由測試各式阿拉伯芥突變株對本土高毒力之青枯病菌 Pss190 品系的耐受性,發現茉莉酸/乙烯訊息傳遞途徑不利植物對抗此病菌,而水楊酸訊息傳遞途徑與植物防禦素 camalexin 則有利植物對抗此病菌。本研究第二部分針對青枯病菌 RSc0727 進行研究, RSc0727 與被推測參與第四型纖毛 (type IV pilus, Tfp) 合成所需的 pilV 基因係同源基因,故本研究將其命名為 pilV 。本研究室先前已發現 pilV 參與 twitching motility 及生物膜生成能力,本研究進一步利用量化分析證實 pilV 跳躍子突變株之生物膜形成能力降低且細胞通透性改變;此外,互補實驗也驗證 pilV 參與青枯病菌在番茄上的病原性,其缺失可能導致細菌系統性感染寄主植物的能力降低。 pilV 的表現會被 PhcA、水楊酸及茉莉酸抑制,推測 Tfp 在青枯病菌致病過程的功能表現可受 PhcA 及植物防禦賀爾蒙調控或干擾。本研究再度驗證精細與縝密的複雜調控系統與青枯病菌能夠成功地適應許多不同環境且具高致病力密不可分。 | zh_TW |
dc.description.abstract | Ralstonia solanacearum is a soil-borne bacterium causing devastating wilting diseases in many economically important crops. Gaining insight into pathogenesis mechanism of this pathogen is thus important. The aim of this work was to study function of R. solanacearum tol-pal gene cluster and RSc0727 in bacterial fitness and pathogenesis. Previously, our group found that transposon (Tn) insertional mutants of tol-pal gene cluster conferred normal virulence on tomato plant, but significantly reduced virulence on Arabidopsis. In addition, these mutants displayed reduced motility, defective cell integrity and altered capability in carbons oxidation. This study, further revealed that tol-pal mutants had normal function in Type III secretion system and displayed normal virulence on additional solanaceous plants. However, stress response and complementation assays indicated that tol-pal gene cluster was essential for cell integrity maintenance and stress tolerance. All of the defects together contributed to the reduced fitness of the tol-pal mutants in the non-host plant Arabidopsis and thus led to severely reduced virulence. Furthermore, this study showed that R. solanacearum tol-pal gene cluster could be organized as five transcription units, which were differentially modulated throughout the growth phase, by the global virulence transcriptional regulalor PhcA, or by stress factors. The multifaceted modulation in tol-pal gene cluster may contribute to R. solanacearum fitness in various environments. By analyzing response of various Arabidopsis Col-0 mutants defective in hormone signaling pathways to infection of a local highly aggressive R. solanacearum Pss190, this study also reveals that the jasmonic acid (JA)/ethylene (ET) signaling pathways play a negative role in Arabidopsis tolerance , while salicylic acid (SA) and camalexin related pathways play positive roles. In the second part of this study, RSc0727, which was a putative orthologue of pilV gene which was suggested to be involved in Type IV pilus (Tfp) biogenesis, was studied. The organization of RSc0727-related gene cluster was mostly conserved among representative gram-negative bacteria alalyzed. Therefore, RSc0727 was designated as pilV. Our previous study showed that pilV is involved in twitching motility and biofilm formation. In this study, quantitative assays further confirmed the reduced biofilm formation and altered cell permeability of pilV mutant. In addition, pathogenesis and complementation assays further evidenced that pilV contributes to full spectrum of virulence. Furthermore, pilV was negatively regulated by PhcA, SA and JA, suggesting that the function of Tfp might be controlled or interfered by PhcA and plant defense mechanisms in the course of R. solanacearum infection. The results of this study together further demonstrate that differentially regulation and sophisticated coordination of various R. solanacearum pathogenesis mechanisms and the involved factors contribute greatly to versatile fitness of R. solanacearum in various abiotic and host environments, leading to its success in infecting a broad range of plant species in wide geographic distribution. | en |
dc.description.provenance | Made available in DSpace on 2021-05-20T21:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ntu-100-R97B42003-1.pdf: 4199543 bytes, checksum: 8e39325821b803f243d05574c60ba0fd (MD5) Previous issue date: 2011 | en |
dc.description.tableofcontents | 口試委員會審定書 i
謝誌 ii 中文摘要 iii 英文摘要 iv 常用名詞之縮寫與全名對照表 vi 目 次 vii 圖目次 x 附錄目次 xi 第一章 前言 1 1. 青枯病 (bacteril wilt) 1 2. 番茄青枯病菌 (Ralstonia solanacearum) 1 3. 青枯病菌之分子致病機制 2 3.1 趨化性 (chemotaxis) 2 3.2 泳動性 (motility) 3 3.3 生物膜 (biofilm) 3 3.4 細胞壁分解酵素 (cell wall drgradation enzyme, CWDE) 4 3.5 胞外多醣體 (exopolysaccharides, EPS) 5 3.6 第三型蛋白分泌系統 (type III secretion system, T3SS) 5 3.7 細菌脂多醣 (lipopolyssacharides, LPS) 6 3.8 PhcA 為青枯病菌致病機制樞紐 7 4. 青枯病菌與植物交互作用 8 4.1 青枯病菌與阿拉伯芥之交互作用 8 4.2 青枯病菌與番茄之交互作用 9 5. 植物防禦素 (phytoalexin) 9 6. tol-pal 基因群研究 11 7. 細菌type IV pilus 與 pilV 基因 12 8. 研究動機與目標 14 第二章 材料與方法 15 1. 供試菌株、質體及菌體培養條件 15 2. 選殖技術與程序 15 2.1 青枯病菌染色體DNA (genomic DNA) 萃取 15 2.2 質體 DNA 萃取 (alkaline lysis) 15 2.3 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 16 2.4 DNA 純化 17 2.5 限制酶消化水解 (digestion) 17 2.6 載體與目標片段接合 (ligation) 17 2.7 構築質體 17 2.8 大腸桿菌勝任細胞的轉型作用 18 2.9 青枯病菌勝任細胞的製備與轉型作用 18 3. 青枯病菌生理特性分析 18 3.1 點盤分析 18 3.2 植物體內增生能力分析 19 3.3 細菌生長遲滯期逆境與植物二次代謝物處理之生長抑制測試 19 3.4 細菌早期對數生長期逆境處理之生長抑制測試 19 3.5 生物膜形成能力測定 (biofilm formation) 19 3.6 API-Zym 酵素測試 20 4. 青枯病菌致病力相關能力之分析 20 4.1 番茄根部附著能力測定 20 4.2 菸草反應測試 20 4.3 番茄病原性測試 21 4.4 阿拉伯芥病原性測試 21 4.5 青枯病菌脂多醣測定 21 5. 啟動子活性分析 22 第三章 結果 24 I. 植物青枯病菌 tol-pal 基因群在致病功能之分析 24 1. 青枯病菌 tol-pal 突變株特性檢測 24 1.1 生物膜形成能力分析 24 1.2 逆境反應分析 24 2. tol-pal 操控子組成與功能性分析 25 2.1 tol-pal 之操控子結構 25 2.2 互補菌株之功能分析 25 3. tol-pal 操控子之調控 26 4. 宿主適應性之探討 26 4.1 在菸草上之病原性測試 26 4.2 阿拉伯芥防禦缺失突變株上之病原性測試 26 II. 植物青枯病菌 RSc0727 在致病功能之分析 27 1. 生物資訊分析 (bioimformatics) 27 2. 青枯病菌 pilV 突變株特性檢測 28 2.1 生物膜形成能力及 API-Zym 酵素的分析 28 2.2逆境反應分析 28 2.3病原性相關因子測試 29 3. pilV 操控子之組成與調控 29 3.1 判定RSc0724~RSc0728 之操控子結構 29 3.2 互補菌株的番茄毒力檢測 30 3.3 互補菌株在 polymyxin B 處理下之生長 30 3.4 pilV 啟動子調控分析 30 第四章 討論 31 I. 植物青枯病菌 tol-pal 基因群在致病功能之分析 31 1. tol-pal 功能缺失造成細胞完整性缺陷 31 2. tol-pal 操控子分五個轉錄單位 32 3. tol-pal 操控子受PhcA 及逆境調控 33 4. tol-pal 突變株之寄主適應性功能異常 33 5. JA/ET、SA 防禦訊息傳遞途徑及 camalexin 皆參與調控阿拉伯芥 Col-0 對青枯病菌 Pss190 感染之耐受性 34 6. 結論 35 II. 植物青枯病菌 RSc0727 在致病功能之分析 36 1. RSc0727 為 Tfp 功能必需 pilV 基因之同源基因 36 2. pilV 缺失影響青枯病菌逆境耐受性 36 3. pilV 缺失影響青枯病菌在番茄上的病原性 37 4. pilV 受 PhcA 及植物防禦訊息傳遞物質調控 38 5. 結論 39 第五章 未來展望 40 參考文獻 41 圖目次 I、tol-pal 基因之功能分析 54 圖一、青枯病菌 tol-pal 突變株生物膜形成 (biofilm formation) 能力 54 圖二、青枯病菌 tol-pal 突變株於生長遲滯期在抗生素與化學藥劑處理下之生長 55 圖三、青枯病菌 tol-pal 突變株於對數生長期在抗生素逆境處理下之生長 56 圖四、青枯病菌 tol-pal 突變株在植物二次代謝物處理下之生長 57 圖五、青枯病菌 RSc0731~RSc0737 基因於早期對數生長期之啟動子活性反應 58 圖六、青枯病菌 tol-pal 互補菌株之逆境反應分析 59 圖七、青枯病菌 pal 互補菌株在阿拉伯芥野生型植株之病原性測試 60 圖八、青枯病菌 tol-pal 啟動子在野生型菌株與 phcA 突變株中的表現 61 圖九、青枯病菌 tolQ 與 tolA 在抗生素處理下啟動子之活性 62 圖十、菸草接種青枯病菌 tol-pal 突變株後之反應 63 圖十一、青枯病菌野生型菌株在阿拉伯芥野生型與 sid2-1 突變植株之病原性測試 64 圖十二、青枯病菌野生型菌株在阿拉伯芥野生型與 pad2 突變植株之病原性測試 65 圖十三、青枯病菌野生型菌株在阿拉伯芥野生型與 pad3 突變植株之病原性測試 66 II、RSc0727 基因之功能分析 67 圖十四、青枯病菌 RSc0727 蛋白質序列分析 67 圖十五、青枯病菌與其他細菌的 PilV 相關操控子結構之比對 68 圖十六、青枯病菌 pilV 突變株生物膜形成能力及 APIzym 酵素分析 69 圖十七、青枯病菌 pilV 突變株在抗生素及化學藥劑及植物二次代謝物處理下之生長 70 圖十八、青枯病菌 pilV 突變株在 polymyxin B 處理下之生長與脂多醣 (LPS) 生合成 71 圖十九、青枯病菌野生型菌株與 pilV 突變株在番茄上之病原性 72 圖二十、青枯病菌 pilV 突變株在茄科植物上之病原性 73 圖二十一、青枯病菌 RSc0724~RSc0728 基因之操控子結構 74 圖二十二、青枯病菌 pilV 互補菌株在番茄上之病原性 75 圖二十三、青枯病菌 pilV 互補菌株在 polymyxin B 處理下之生長 76 圖二十四、青枯病菌 RSc0726 與 pilV 啟動子在野生型菌株、phcA 突變株中及逆境因子處理下之表現 77 附錄目次 附錄一、實驗室前人檢測野生型青枯病菌及 tol-pal 突變株在番茄及阿拉伯芥上的病原性以及纏據能力 78 附錄二、青枯病菌 tol-pal 基因隨生長時期表現之啟動子活性反應 79 附錄三、青枯病菌 tolA 互補菌株在阿拉伯芥野生型植株之病原性測試 80 附錄四、青枯病菌 tolQ 互補菌株在阿拉伯芥野生型植株之病原性測試 81 附錄五、青枯病菌野生型菌株於阿拉伯芥野生型與防禦基因突變植株及轉殖株病原性測試 82 附錄六、實驗室前人所進行之青枯病菌 pilV 突變株特性檢測 83 附錄七、實驗室前人所進行之青枯病菌 tol-pal 突變株特性檢測 84 附錄八、青枯病菌與其他細菌之 tol-pal 操控子組成 85 附錄九、實驗室前人所進行之青枯病菌 tol-pal 碳源氧化能力測試 86 附錄十、 Camalexin 生合成路徑圖 87 附錄十一、青枯病菌複雜的致病調控系統 88 附錄十二、阿拉伯芥 SA、JA、ET 防禦訊息傳導途徑綜觀圖 89 附錄十三、 Tol-Pal 在細胞膜上之位置與組成 90 附錄十四、本研究中所使用之引子 91 附錄十五、本實驗所使用之質體與菌株 93 附錄十六、本研究所使用培養基及藥劑配方 97 | |
dc.language.iso | zh-TW | |
dc.title | 植物青枯病菌 tol-pal 基因群及 RSc0727 在致病功能之分析 | zh_TW |
dc.title | Functional study of Ralstonia solanacearum tol-pal gene cluster and RSc0727 in pathogenesis | en |
dc.type | Thesis | |
dc.date.schoolyear | 99-1 | |
dc.description.degree | 碩士 | |
dc.contributor.oralexamcommittee | 陳文盛,鄭石通,葉國楨,林乃君 | |
dc.subject.keyword | 青枯病菌,tol-pal,PhcA,第四型纖毛,pilV,RSc0727, | zh_TW |
dc.subject.keyword | R. solanacearum,tol-pal,PhcA,Type IV pilus,RSc0727,pilV, | en |
dc.relation.page | 101 | |
dc.rights.note | 同意授權(全球公開) | |
dc.date.accepted | 2011-02-15 | |
dc.contributor.author-college | 生命科學院 | zh_TW |
dc.contributor.author-dept | 植物科學研究所 | zh_TW |
顯示於系所單位: | 植物科學研究所 |
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